CCL4誘導小鼠肝臟纖維化模型

1. 該模型鑒定和評價的技術方法和指標體系，符合潰瘍性結腸炎的病理特點，尤其與潰瘍性結腸炎反復發作、遷延不愈的臨床特點高度相似。

（1） 疾病活動指數

（2） 結腸指數

（3） 結腸組織大體評分

（4） HE 染色病理觀察

（5） MPO 酶活性檢測

2. 與國內外現有模型的異同

現有的潰瘍性結腸炎的造模方法有單一化學法刺激、免疫法、免疫復合法、基因修飾法。雖然現在建造UC動物模型的方法多種多樣，但是依舊存在著或多或少的缺陷。理想模型要簡單易操作，同時盡可能全面、準確的模擬人類UC的病理生理學特點和表現，既要與自發的炎癥誘因相近，又要符合腸道炎癥進展、組織損傷進展等，同時模型病變盡量維持較長時間，能盡量反映慢性病變的過程和特點，以滿足實驗的需求。而目前尚缺乏能滿足這些要求的模型，且已有模型以急性損傷模型為主。故亟待尋找更好的，具有良好重復性、穩定性，并且操作簡單的動物模型，從而為研究UC發病機制、研發治療新藥物提供良好的基礎。

3. 本研究的主要創新點或技術關鍵

3.1 創新點

本模型采用誘導劑聯用的方法，建立慢性、炎癥維持時間長且病程穩定的小鼠慢性 UC 造模方法。該模型改進了傳統潰瘍性結腸炎模型的病程短、穩定性差、模型指標缺少特異性等問題，更大程度的模擬了臨床慢性潰瘍性結腸炎病理指標。

3.2 關鍵技術

采用噁唑酮和2,4,6-三硝基苯磺酸兩種誘導劑聯用、致敏與感染相結合的方法，建立了新慢性、炎癥維持時間長且病程穩定的小鼠慢性 UC 模型方法。

4. 可行性分析

4.1 前期摸索研究充分，通過閱讀大量中外文獻，較充分的了解潰瘍性結腸炎疾病以及模型建立過程中的問題。

4.2 實驗單位具備動物飼養許可證以及較先進的實驗器材和檢測設備。

4.3 通過閱讀大量中外文獻和走訪調研，噁唑酮和三硝基苯磺酸在臨床上應用廣泛，效果明顯，具有可行性。

本實驗采用昆明種6-8周齡的健康成年小鼠，體重均在33±2g，SPF級。飼料墊料均為高壓滅菌產品，購自北京斯貝福生物科技股份有限公司，動物用水為實驗室制UP水經過除菌處理。飼養及實驗操作均于具有檢驗合格資質的SPF級屏障動物室內進行，并且實驗動物以完整的包裝直接進入屏障實驗室，觀察室適應7天后無異常情況，方可進行實驗。所有實驗中小鼠均引頸處死，盡量減少動物手術創傷程度及失血量。實驗過程中動物操作均符合動物倫理學規范，對環境和生態影響等符合國家相關法律規定。

一、肝臟大體形態變化

腹腔注射CCl4的油劑溶液（50ul/10g體重，CCl4：橄欖油=1:9），每周注射三次，隔一天一次，連續注射4周，取肝臟組織。

圖1肝臟大體形態

二、肝臟纖維化指標檢測

腹腔注射CCl4的油劑溶液（50ul/10g體重，CCl4：橄欖油=1:9），每周注射三次，隔一天一次，連續注射4周，取肝臟組織行Western Blot檢測肝纖維化相關蛋白

圖2 肝臟組織纖維化相關蛋白表達情況

三、肝臟馬松染色

腹腔注射CCl4的油劑溶液（50ul/10g體重，CCl4：橄欖油=1:9），每周注射三次，隔一天一次，連續注射4周，取肝臟組織，10%福爾馬林固定，制成石蠟切片行馬松染色。

圖3 肝臟組織馬松染色

1.C57小鼠，

品系來源 ：1)遺傳背景及亞系:1921年Ltle用 Abbg Lathrop的小鼠株雌鼠57號與雄鼠52號交配，而得C57BL6。亞系:C57BL6、C57B/6、C57BL/6N等。 (2)毛色基因標記：aa、BB、CC（黑色）

(3)主要遺傳學特征：a免疫學特征：一般飼養條件下免疫球蛋白的量隨年齡而增加，而到生后20個月時則1gG增長緩慢，無菌飼養的絕對量較低。IgM水平較高，出生12月以后，有的個體超過80ug/mL。無菌飼養的動物lgM量比一般飼養的高。細胞免疫低下者少見，這可能與自發腫瘤少有關。b。形態學特征：在新生鼠中，雌鼠為16.8%，雄鼠3%為小眼或無眼癥。0.6%后肢可見多趾癥，另外水頭癥占2%~4%，耳頭癥占0.4%，交合不全占3%。c生理學特性：有強嗜酒精性。對放射性照射為中等強度感應度，LD50為630+4R，將雄鼠皮膚移植到同系的雌鼠身上，約20日被排斥掉，這是因為在組織相容性抗原中的雄抗原在C57BL中非常顯著。d癌發生率：乳癌發生率低,不足1%，白血病為7%-16%化學致癌成功率低，放射性照射較容易誘發肝癌。

2.肝纖維化對照小鼠：C57 小鼠 ，名稱：C57。

3.誘導方法：腹腔注射CCl4的油劑溶液（50 ul/10g體重，CCl4：橄欖油=1:9），每周注射三次，隔一天一次，連續注射4-6周，每周稱重一次，實驗結束前，禁食4小時，取血液測量血生化等指標，取肝臟進行稱重，病理及相關蛋白分析。

肝纖維化是一個病理生理過程，是指由各種致病因子所致肝內結締組織異常增生。任何肝臟損傷在肝臟修復愈合的過程中都有肝纖維化的過程，如果損傷因素長期不能去除，纖維化的過程長期持續就會發展成肝硬化。臨床癥狀常見疲乏無力、食欲減退、慢性消化不良、出血等。治療主要是針對原發病的病因治療。病因多見于病毒性肝炎、酒精肝、脂肪肝、自身免疫性疾病等。

四氯化碳動物模型是目前應用于抗肝損傷和纖維化藥物評估的主要研究模型。其作用機制為：在肝細胞內質網中，四氯化碳被肝微粒體細胞色素P450氧化酶激活后生成三氯化碳，與肝細胞內大分子發生共價結合，破壞肝細胞功能。此外，還可攻擊肝細胞膜的磷脂，引起脂質過氧化破壞膜性結構，損傷肝細胞。