H5N1滴鼻感染雪貂模型

到目前為止，已經報道有2種非人靈長類動物（恒河猴、食蟹猴）和4種嚙齒類動物（大鼠、小鼠、田鼠、沙鼠），雪貂、家貓以及雞、鴨等禽類可以作為H5N1禽流感病毒動物模型用于實驗研究。低致病性H5N1禽流感病毒可以通過適應建立鼠肺適應株感染小鼠建立小鼠模型。非人靈長類動物通過鼻腔吸入較難感染，通常需要借助輔助器材進行定位感染，動物感染后體征變化不顯著，肺組織出現局灶性病變。

前期研究顯示雪貂的受體分布情況與人極為接近，呼吸氣道長，上下呼吸道分腔明顯是流感病毒研究最為理想的動物模型，缺點是雪貂受物種特異性限制缺乏相應的檢測試劑。小鼠對多種流感病毒敏感，一直被選擇作為流感病毒研究的動物模型，不僅有完備的檢測試劑，還有相應的基因敲除、轉基因小鼠可用于機制方面的研究。早期研究曾在多種非人靈長類動物中（非洲綠猴、Pata猴、豬尾猴、食蟹猴）檢測到血清抗體陽性，并推測猴群感染病毒參與了流感大流行。研究發現非人靈長類動物感染禽流感病毒后的臨床改變、病理變化、抗原分布都與人類存在一定差異，研究結果顯示其對流感病毒敏感性較雪貂、小鼠低。至今沒有直接證據表明非人靈長類動物的受體分布情況與人接近。恒河猴中研究局部肺組織損傷機制不僅與巨噬細胞有關，在研究抗補體機制中還應考慮PAMP的參與，NF-κB 等炎癥信號途徑的作用，這些研究在非人靈長類中受到一定限制，目前小鼠可以提供多方面抗補體機制研究。

1 受體比較

1) 人呼吸道上皮受體分布情況：α-2，6連接唾液酸糖蛋白受體主要分布在鼻粘膜上皮細胞, α-2，3連接唾液酸糖蛋白受體分布在鼻旁竇、咽、氣管、細支氣管上皮上。在終端呼吸性細支氣管上皮細胞也表達α-2，6連接唾液酸糖蛋白受體。α-2，3連接唾液酸糖蛋白受體出現在呼吸細支氣管與肺泡交界的無纖毛立方細支氣管細胞上，部分肺泡壁細胞表達這種受體，這種細胞為肺泡Ⅱ型細胞。病人感染H5N1禽流感病毒后，病毒主要分布在肺泡Ⅱ型細胞內。

2) 雪貂除了氣管中極少數杯狀細胞既表達α-2，3SA受體又α-2，6SA受體，其上下呼吸道受體分布與人極為相似，小鼠多表達α-2，3SA受體，α-2，6SA受體較少，曾局限的認為小鼠較適合用于α-2，3SA受體結合的病毒研究，后有研究發現受體特異性并不影響某些病毒對小鼠的致病力和復制能力。

3)有研究顯示通過體外實驗證實非洲綠猴上皮細胞與人類流感病毒和禽類流感病毒都有較好的結合能力，與人類上皮細胞的結合能力接近。缺乏實驗證據顯示其受體與人類受體分布相似度。

2 感染途徑比較

1) 小鼠、雪貂通過輕微麻醉后，以吸入式方式感染，感染方式與人極為接近。

2) 恒河猴、綠猴、食蟹猴等需要以環甲膜穿刺、支氣管鏡定位感染等方式進行感染，感染途徑與自然感染途徑差別較大，感染效果通常會出現肺組織局域性灶狀感染，與吸入性感染方式產生的病變程度、范圍存在一定差別。

3 感染后癥狀

1) 部分禽流感病毒在猴上皮細胞中復制受限或者發生不同程度的衰減。例如禽來源的H2N2病毒不能感染猴，H5N1高致病性禽流感病毒需要以高出雪貂感染劑量103倍的劑量感染猴，仍不致死，僅產生一過性體溫升高。

2) 幾乎所有禽流感病毒都能夠在雪貂中成功復制，并產生臨床可觀察的改變，例如體溫升高、體重下降、噴嚏、流涕、精神萎靡甚至死亡。

3)H5N1禽流感病毒感染小鼠后出現嚴重的肺炎，除呼吸道以外還在腦、脾、肝等組織中發現病毒抗原，并在腦組織中出病理改變，猴感染后在呼吸道以外的組織中未發現病毒抗原。

CRP基因敲除小鼠和人CRP轉基因小鼠在賽業（蘇州）生物科技有限公司模式動物研究中心完成，該中心具有符合國際標準的動物模型制備相關完備監督管理制度。動物的繁殖及感染模型評估在中國疾控中心動物中心完成，所有操作在SFP級別下遵守二級生物安全管理規定進行，實驗動物尸體實行無害化處理，對生態環境無影響。

1.雪貂感染后臨床表現

雪貂感染后出現體重下降，感染后第1天一直持續到實驗結束，雪貂在感染后體重下降最高達15%以上，體重變化見圖1A。雪貂感染后出現體溫升高，與感染前比較體溫最高上升2℃。感染后第2天出現體溫升高，一直持續到實驗結束（感染后第5天），體溫變化見圖1。

圖1.雪貂感染后體重變化率%(A)；體溫變化℃（B）。體重變化率%=（當天體重-0天體重）/0天體重*100%

雪貂感染然后顯著的臨床癥狀變化，根據其表現設立了評分標準：NIH提供的雪貂感染實驗觀察指標分為鼻部癥狀和活動度兩個部分，具體指標見表1。

雪貂感染后出現以活動度下降為主臨床改變，即表現為不活躍、對外界刺激的反應性下降，上呼吸道感染的癥狀如，打噴嚏、流鼻涕、呼吸困難等表現。感染后第5天1只雪貂死亡，被感染雪貂死亡前臨床沒有出現驟然體溫升高、呼吸急促、呼吸困難等癥狀。雪貂感染后臨床變化情況見圖2。

2 感染雪貂組織病理損傷檢查

雪貂感染H5N1禽流感病毒第5天后肺組織大體呈現多個肺葉腹側面和背側面出現片狀灶狀的壞死灶和出血灶，其他組織大體觀察未發現明顯異常。鏡下觀察發現肺組織呈炎性充血、出血、水腫、壞死、滲出的重度肺炎病理改變。大腦組織可見局灶性腦炎，血管周圍炎細胞呈“套袖”裝浸潤，可見小灶狀壞死。免疫組化染色可以觀察到，盡管小腸組織沒有觀察到病變，在肺組織、腦組織、小腸組織均可以看到被病毒感染的陽性細胞。

對照組動物的肺（A）、大腦（D）、小腸（G）未見異常。感染組動物肺臟呈重度滲出壞死性肺炎改變，大量炎細胞、水腫液廣泛滲出，可見壞死出血灶（B）；大腦組織可見局灶性腦炎，血管周圍炎細胞呈“套袖”裝浸潤，可見小灶狀壞死（E）；小腸組織未見異常（H）。免疫組化顯示感染動物的肺（C）、大腦（F）、小腸（I）均可見大量感染病毒的細胞。A、B、D、E、G、H：HE×100；C、F、I：IHC×200

3 感染雪貂組織中病毒復制動力曲線

雪貂感染后，每天取鼻甲骨活檢物做病毒滴度測定，結果顯示雪貂在感染后第1-5天都檢測到病毒，病毒滴度為102.3-103.8 TCID50。病毒滴度檢測表明雪貂在感染后上呼吸道呈持續復制趨勢。上呼吸道病毒復制結果見表2。

雪貂在感染后第5天安樂處死，取雪貂氣管、肺、心、肝、脾、腎、小腸、腦組織做病毒滴度測定。結果顯示各個組織都能夠分離到病毒，其中以氣管和肺組織的病毒滴度最高，病毒分離的陽性率為13/24。以上的結果反映了H5N1病毒感染雪貂，呼吸系統的器官是病毒侵襲的重要對象，呼吸系統以外的器官也會受到病毒的攻擊，并且病毒可以突破血腦屏障感染腦組織，這就解釋了為什么感染禽流感病毒病人會出現多系統多器官受損和出現神經系統的癥狀。各組織臟器病毒滴度結果見表3。

雪貂呼吸道解剖結構上下呼吸道分腔明顯，受體分布與人極為接近，是迄今為止最為敏感的流感病毒感染動物模型。它對人流感病毒高度易感，病毒不經適應即能使雪貂致病，并易傳播給雪貂和人。在自然條件下，雪貂一般也是通過呼吸道吸入病毒的方式感染流感病毒，其感染后的發病過程和機體反應也與人體相似。雪貂除對人流感病毒高度易感外，對禽流感、豬流感病毒也十分敏感，且感染后出現典型癥狀。

去勢雪貂（Mustela Pulourius Furo），4-10月齡，500-1000克。 實驗前進行血清學檢查，HI方法檢測H1N1，H5N1抗體，抗體陰性為合格雪貂方可入組實驗。

該研究項目在BSL-3 實驗室中進行。病毒株為H5N1 A/ Vietnam/1203/2004，雪貂經過輕度麻醉后滴鼻感染病毒。實驗的觀察期為5天。皮下植入體溫芯片用于監測體溫、體重變化。每日觀察雪貂臨床癥變化，在感染后第5天處死動物，取組織樣本用于監測病毒復制動力曲線和動物感染后組織炎癥反應檢查。

禽流感依據其對禽類的致病能力大小可以分為三個程度：高致病性、低致病性和無致病性。其中高致病性禽流感包括H5和H7 兩個亞型。但并非所有的H5 和H7 都是強毒株。人高致病性禽流感是由高致病性禽流感病毒某些亞型的毒株引起的人急性呼吸道傳染病。由H5N1亞型禽流感引起的癥狀較重，病死率高。1997年，香港一名3歲的男童因感染禽流感而死亡，在隨后的幾個月中，共有18個人感染禽流感病毒，其中6人死亡。之后相繼有 H9N2、H7N7 亞型禽流感感染人類和 H5N1 亞型再次感染人類的報道,禽流感與人禽流感的關系開始倍受關注。2003年12 月中旬開始至今,朝鮮、越南、泰國、韓國、日本和中國等10 余個亞洲國家先后暴發H5N1高致病性禽流感疫情, 并且再越南、泰國、柬埔寨以及印度尼西亞出現了人感染高致病性禽流感病毒病例。據最新資料報道，世界衛生組織已證實泰國、越南和柬埔寨以及印度尼西亞自2004年1月起截至到2005年8月20日共有112人感染，其中導致57人死亡。而H7N7感染引起的癥狀相對較輕僅以眼角結膜炎和輕微的呼吸道癥狀為主。追溯歷史，有報道的第一次禽流感感染人的事件發生在上個世紀的70-80年代的幾例以自限性結膜炎為臨床特征的H7N7感染病患。最近的一次發生在2003年荷蘭一家農場有近80名工人及家屬被確診為H7N7感染,他們以眼部感染和呼吸道癥狀為主,其中一名獸醫死亡,他的家人未接觸病禽但也被證實H7N7感染。這起事件具有有限的人傳人的證據。

禽流感病毒感染患者臨床表現及致病機制

H5N1禽流感病毒感染的潛伏期一般為2～4天，平均3天。發病前1天就開始排毒，排毒時間兒童比成人長，免疫抑制者排毒可長達一個多月。臨床表現為急性起病，早期表現類似一般流感。主要為發熱，體溫大多持續在38℃以上，熱程1～7天，一般為3～4天，可伴有流涕、鼻塞、咳嗽、咽痛、頭痛和渾身不適。少數患者可有惡心、腹瀉、稀水樣便等癥狀。重癥患者病情發展迅速，可出現肺炎、急性呼吸窘迫綜合征、肺出血、胸腔積液、全血細胞減少，腎功能衰竭，敗血癥、休克及Reye綜合征等多種并發癥。