H9N2滴鼻感染BALB/c小鼠模型

到目前為止，已經報道有2種非人靈長類動物（恒河猴、食蟹猴）和4種嚙齒類動物（大鼠、小鼠、田鼠、沙鼠），雪貂、家貓以及雞、鴨等禽類可以作為H5N1禽流感病毒動物模型用于實驗研究。低致病性H5N1禽流感病毒可以通過適應建立鼠肺適應株感染小鼠建立小鼠模型。非人靈長類動物通過鼻腔吸入較難感染，通常需要借助輔助器材進行定位感染，動物感染后體征變化不顯著，肺組織出現局灶性病變。

前期研究顯示雪貂的受體分布情況與人極為接近，呼吸氣道長，上下呼吸道分腔明顯是流感病毒研究最為理想的動物模型，缺點是雪貂受物種特異性限制缺乏相應的檢測試劑。小鼠對多種流感病毒敏感，一直被選擇作為流感病毒研究的動物模型，不僅有完備的檢測試劑，還有相應的基因敲除、轉基因小鼠可用于機制方面的研究。早期研究曾在多種非人靈長類動物中（非洲綠猴、Pata猴、豬尾猴、食蟹猴）檢測到血清抗體陽性，并推測猴群感染病毒參與了流感大流行。研究發現非人靈長類動物感染禽流感病毒后的臨床改變、病理變化、抗原分布都與人類存在一定差異，研究結果顯示其對流感病毒敏感性較雪貂、小鼠低。至今沒有直接證據表明非人靈長類動物的受體分布情況與人接近。恒河猴中研究局部肺組織損傷機制不僅與巨噬細胞有關，在研究抗補體機制中還應考慮PAMP的參與，NF-κB 等炎癥信號途徑的作用，這些研究在非人靈長類中受到一定限制，目前小鼠可以提供多方面抗補體機制研究。

受體比較

1) 人呼吸道上皮受體分布情況：α-2，6連接唾液酸糖蛋白受體主要分布在鼻粘膜上皮細胞, α-2，3連接唾液酸糖蛋白受體分布在鼻旁竇、咽、氣管、細支氣管上皮上。在終端呼吸性細支氣管上皮細胞也表達α-2，6連接唾液酸糖蛋白受體。α-2，3連接唾液酸糖蛋白受體出現在呼吸細支氣管與肺泡交界的無纖毛立方細支氣管細胞上，部分肺泡壁細胞表達這種受體，這種細胞為肺泡Ⅱ型細胞。病人感染H5N1禽流感病毒后，病毒主要分布在肺泡Ⅱ型細胞內。

2) 雪貂除了氣管中極少數杯狀細胞既表達α-2，3SA受體又α-2，6SA受體，其上下呼吸道受體分布與人極為相似，小鼠多表達α-2，3SA受體，α-2，6SA受體較少，曾局限的認為小鼠較適合用于α-2，3SA受體結合的病毒研究，后有研究發現受體特異性并不影響某些病毒對小鼠的致病力和復制能力。

3)有研究顯示通過體外實驗證實非洲綠猴上皮細胞與人類流感病毒和禽類流感病毒都有較好的結合能力，與人類上皮細胞的結合能力接近。缺乏實驗證據顯示其受體與人類受體分布相似度。

6.2感染途徑比較

1) 小鼠、雪貂通過輕微麻醉后，以吸入式方式感染，感染方式與人極為接近。

2) 恒河猴、綠猴、食蟹猴等需要以環甲膜穿刺、支氣管鏡定位感染等方式進行感染，感染途徑與自然感染途徑差別較大，感染效果通常會出現肺組織局域性灶狀感染，與吸入性感染方式產生的病變程度、范圍存在一定差別。

感染后癥狀

1) 部分禽流感病毒在猴上皮細胞中復制受限或者發生不同程度的衰減。例如禽來源的H2N2病毒不能感染猴，H5N1高致病性禽流感病毒需要以高出雪貂感染劑量103倍的劑量感染猴，仍不致死，僅產生一過性體溫升高。

2) 幾乎所有禽流感病毒都能夠在雪貂中成功復制，并產生臨床可觀察的改變，例如體溫升高、體重下降、噴嚏、流涕、精神萎靡甚至死亡。

3)H5N1禽流感病毒感染小鼠后出現嚴重的肺炎，除呼吸道以外還在腦、脾、肝等組織中發現病毒抗原，并在腦組織中出病理改變，猴感染后在呼吸道以外的組織中未發現病毒抗原。

CRP基因敲除小鼠和人CRP轉基因小鼠在賽業（蘇州）生物科技有限公司模式動物研究中心完成，該中心具有符合國際標準的動物模型制備相關完備監督管理制度。動物的繁殖及感染模型評估在中國疾控中心動物中心完成，所有操作在SFP級別下遵守二級生物安全管理規定進行，實驗動物尸體實行無害化處理，對生態環境無影響。

1.小鼠模型感染后臨床癥狀變化

小鼠感染H9N2病毒后的存活情況如圖1A所示，其中接種野生病毒株的小鼠14天內全部存活，而接種鼠肺適應株的小鼠5天內全部死亡。小鼠感染106 EID50鼠肺適應株后，第1天開始出現體重下降的現象，體重下降明顯，迅速死亡，而接種野生病毒株的小鼠，體重處于持續增長的狀態（圖1B）。

(A) 小鼠分別感染PBS、WT或鼠肺適應株病毒后的存活率。

(B) 小鼠分別感染PBS、WT或鼠肺適應株病毒后的體重下降情況。

2.小鼠模型感染后病毒在組織中復制情況

接種106 EID50病毒的小鼠在感染后3，5天各安樂解剖3只，來分析病毒的組織分布。感染后第3天各組小鼠的肺組織中均可檢測到排毒，但鼠肺適應株組明顯高于野生組，存在顯著性差異（圖2）。雞胚滴度測定結果可見P12-1，p12-2，P12-3代病毒感染的小鼠肺組織病毒滴度顯著高于P0代感染的小鼠（P<0.01），并且在小鼠的肝、腎、腦、腸等組織中檢測到病。

3. 小鼠模型感染后血清特異性抗體產生情況

感染后第14天，對存活小鼠的眼眶靜脈叢血清進行血凝抑制實驗（HI），測定對H9N2病毒的特異性抗體效價，結果證實所有存活小鼠（僅WT組）均出現抗血清轉陽，對WT病毒的HI效價達320-1280。而對鼠肺適應株的HI效價只有20-160。

小鼠是用于評估流感感染最常用的哺乳動物模型。小鼠的品種和品系很多，是實驗室動物中培育品系最多的動物，其遺傳學背景也研究的比較詳盡。優點是價格相對低廉，遺傳譜系清晰，品系純正，供給充足；當然也有著多方面的缺點，主要表現在：首先小鼠不是流感的天然宿主還缺少人流感病毒的臨床癥狀；多數毒株感染后表現為體溫過低而非發熱；不能傳播病毒。

實驗用小鼠在其呼吸道上通常表達SAα2,3Gal和SAα2,6Gal兩種唾液酸受體，因此對人流感病毒、禽流感病毒都較為易感。但人A型流感病毒（H1、H2、H3）一般要經過在小鼠上適應性傳代才能有效復制，而一些低致病性和高致病性禽流感如H5N1、H2、H6和H7病毒則不需要適應傳代即可感染。特別是對于H5和H7等高致病性禽流感病毒感染不僅僅局限于小鼠的呼吸組織，還包括腦、脾臟、胸腺、腎、肝臟和心臟等器官。小鼠全身性的病毒感染主要是因為各個臟器中都存在裂解HA蛋白的水解酶，小鼠除了出現呼吸癥狀外還會表現出后肢麻痹等神經系統癥狀。但也有例外，當用高劑量的并無多個堿性裂解位點的A/WSN/1933（H1N1）毒株滴鼻感染小鼠，小鼠腦組織也會感染病毒并出現神經癥狀。所以僅有受體分布并不能完全決定流感病毒的宿主范圍。

制作流感病毒感染動物模型多應用SPF級雌性BALB/c小鼠，4-6周齡。

將分離得到的H9N2病毒毒株（A/brambling/Beijing/16/2012，Genbank：KC464595.1、KC464596.1、KC464597.1、KC464598.1、KC464599.1、KC464600.1、KC464601.1、KC464602.1)在小鼠體內進行連續傳代，純化病毒，得到3個鼠肺適應株，命名為：P12-1、 P12-2、 P12-3。使用4-6周齡SPF級雌性BALB/c小鼠，麻醉后滴鼻感染，小鼠感染后觀察14天，監測存活率及體重變化率。感染后分時間段安樂死小鼠，收集小鼠肺、脾、腦、心、腎等組織，進行病毒滴度測定。

流感病毒是嚴重威脅人類健康的一種病原體，它能導致流感疫情甚至世界大流行，流感在各個年齡階段的人群中都可能爆發而引起急性發熱性呼吸道疾病。流感病毒為單股負鏈RNA病毒，屬于正黏液病毒科，呈球形或絲狀，直徑80-120nm。病毒外層為兩種不同糖蛋白構成的輻射狀突起，即血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)。根據HA和NA抗原的不同，又可分為許多亞型，H可分為16個亞型，N有9個亞型(N1～N9)。在所有的流感亞型中，H9N2備受關注，H9N2分布區域廣泛，偶爾還可以感染人。值得注意的是，H5N1、H7N9、H10N8亞型禽流感的6個內部基因均來自H9N2亞型病毒。文獻報道H9N2亞型不經過適應即可在小鼠體內進行有效復制。另外，有文獻報道，H9N2病毒在獲得2009年甲型H1N1病毒內部基因后即可在雪貂群體間通過氣溶膠傳播。

一般感染H9N2的潛伏期為2～4d,平均3d。臨床急性起病，早期表現類似一般流感,主要為發熱，體溫大多持續在39℃以上，熱程1～7d，一般為3～4d,可伴有流涕、鼻塞、咳嗽、咽痛、頭痛和周身不適，少數患者有惡心、腹痛、腹瀉、稀水樣便等癥狀。重癥患者病情發展迅速，可出現肺炎、急性呼吸窘迫綜合征、肺出血、胸腔積液、全血細胞減少、腎功能衰竭、敗血癥、休克及Reye綜合征等多種并發癥。感染H9N2預后良好。