過敏性哮喘挪威褐鼠模型

1. 該模型鑒定和評價(jià)的技術(shù)方法和指標(biāo)體系，符合潰瘍性結(jié)腸炎的病理特點(diǎn)，尤其與潰瘍性結(jié)腸炎反復(fù)發(fā)作、遷延不愈的臨床特點(diǎn)高度相似。

（1） 疾病活動指數(shù)

（2） 結(jié)腸指數(shù)

（3） 結(jié)腸組織大體評分

（4） HE 染色病理觀察

（5） MPO 酶活性檢測

2. 與國內(nèi)外現(xiàn)有模型的異同

現(xiàn)有的潰瘍性結(jié)腸炎的造模方法有單一化學(xué)法刺激、免疫法、免疫復(fù)合法、基因修飾法。雖然現(xiàn)在建造UC動物模型的方法多種多樣，但是依舊存在著或多或少的缺陷。理想模型要簡單易操作，同時(shí)盡可能全面、準(zhǔn)確的模擬人類UC的病理生理學(xué)特點(diǎn)和表現(xiàn)，既要與自發(fā)的炎癥誘因相近，又要符合腸道炎癥進(jìn)展、組織損傷進(jìn)展等，同時(shí)模型病變盡量維持較長時(shí)間，能盡量反映慢性病變的過程和特點(diǎn)，以滿足實(shí)驗(yàn)的需求。而目前尚缺乏能滿足這些要求的模型，且已有模型以急性損傷模型為主。故亟待尋找更好的，具有良好重復(fù)性、穩(wěn)定性，并且操作簡單的動物模型，從而為研究UC發(fā)病機(jī)制、研發(fā)治療新藥物提供良好的基礎(chǔ)。

3. 本研究的主要創(chuàng)新點(diǎn)或技術(shù)關(guān)鍵

3.1 創(chuàng)新點(diǎn)

本模型采用誘導(dǎo)劑聯(lián)用的方法，建立慢性、炎癥維持時(shí)間長且病程穩(wěn)定的小鼠慢性 UC 造模方法。該模型改進(jìn)了傳統(tǒng)潰瘍性結(jié)腸炎模型的病程短、穩(wěn)定性差、模型指標(biāo)缺少特異性等問題，更大程度的模擬了臨床慢性潰瘍性結(jié)腸炎病理指標(biāo)。

3.2 關(guān)鍵技術(shù)

采用噁唑酮和2,4,6-三硝基苯磺酸兩種誘導(dǎo)劑聯(lián)用、致敏與感染相結(jié)合的方法，建立了新慢性、炎癥維持時(shí)間長且病程穩(wěn)定的小鼠慢性 UC 模型方法。

4. 可行性分析

4.1 前期摸索研究充分，通過閱讀大量中外文獻(xiàn)，較充分的了解潰瘍性結(jié)腸炎疾病以及模型建立過程中的問題。

4.2 實(shí)驗(yàn)單位具備動物飼養(yǎng)許可證以及較先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)器材和檢測設(shè)備。

4.3 通過閱讀大量中外文獻(xiàn)和走訪調(diào)研，噁唑酮和三硝基苯磺酸在臨床上應(yīng)用廣泛，效果明顯，具有可行性。

本實(shí)驗(yàn)采用昆明種6-8周齡的健康成年小鼠，體重均在33±2g，SPF級。飼料墊料均為高壓滅菌產(chǎn)品，購自北京斯貝福生物科技股份有限公司，動物用水為實(shí)驗(yàn)室制UP水經(jīng)過除菌處理。飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)操作均于具有檢驗(yàn)合格資質(zhì)的SPF級屏障動物室內(nèi)進(jìn)行，并且實(shí)驗(yàn)動物以完整的包裝直接進(jìn)入屏障實(shí)驗(yàn)室，觀察室適應(yīng)7天后無異常情況，方可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)中小鼠均引頸處死，盡量減少動物手術(shù)創(chuàng)傷程度及失血量。實(shí)驗(yàn)過程中動物操作均符合動物倫理學(xué)規(guī)范，對環(huán)境和生態(tài)影響等符合國家相關(guān)法律規(guī)定。

哮喘反應(yīng)（速發(fā)相和遲發(fā)相）、病理改變（包括肺炎細(xì)胞浸潤和黏液分泌等）、血免疫指標(biāo)（血清IgE及相關(guān)免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子）等。

1.特異性IgE結(jié)果

由表1可以看出，除OVA 0.01組，OVA 0.1、OVA 1、OVA 10、OVA 0.1 + Al(OH)3 100、OVA 1 + Al(OH)3 100、OVA 10 + Al(OH)3 100、OVA 1 + Al(OH)3 52、OVA 1 + Al(OH)3 4、OVA 10 + Al(OH)3 gel 4組血清IgE含量與正常對照組相比均顯著升高（P < 0.05），且隨OVA劑量增大，IgE含量升高，加入佐劑組比單純OVA組抗體含量高。OVA 10 + Al(OH)3 100組與OVA 10+ Al(OH)3 gel 4組的IgE含量無顯著差異，均較其他組高，以O(shè)VA 10 + Al(OH)3 100組為最高。如表1、2，OVA 10組與相當(dāng)于其1 % OVA含量但加入了一定佐劑的OVA 0.1+ Al(OH)3 100組產(chǎn)生的抗體含量相當(dāng)，且滴度相同，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。從圖1模型組（OVA 10 + Al(OH)3 100組為代表），IgE含量隨時(shí)間變化曲線可以看出，致敏后IgE水平呈現(xiàn)時(shí)間依賴性增長，在第1周內(nèi)與正常對照組無明顯差異，1周后IgE水平開始快速升高，在第2周內(nèi)劇烈增長，2周后漲幅變緩慢呈現(xiàn)穩(wěn)定的持續(xù)增長，在第5周達(dá)最高值，d 38時(shí)略有下降。

Fig. 1 The curve of IgEcontent changes over time

圖 1 IgE含量隨時(shí)間變化曲線

Tab. 1The influence of different sensitization methods to day35 IgE content

表1 不同致敏方法對d 35 IgE含量的影響

Tab. 2The IgE titer of the day 35 sera of OVA 10 and OVA 0.1 + Al(OH)3 100 groups

表2 OVA 10和OVA 0.1 + Al(OH)3 100組d 35的IgE滴度

2.哮喘發(fā)作全過程記錄結(jié)果

正常對照組激發(fā)后的Penh曲線在16 h內(nèi)較穩(wěn)定，沒有明顯波動（圖2A）。其Penh限值為1.14（0.90+3*0.08），大于1.14即為Penh值升高。與正常對照組相比（圖2B），致敏組（OVA 10 + Al(OH)3 100組為代表）激發(fā)后Penh值立即升高，其Penh曲線在前1 h內(nèi)有明顯上升（圖3B）。之后曲線有輕度下降，再開始劇烈上升達(dá)峰值后劇烈下降再緩慢下降至基線水平（圖3A）。如表3所示，單一OVA 0.1mg至10mg致敏，激發(fā)后均出現(xiàn)氣道反應(yīng)。低劑量時(shí)僅有EAR，隨劑量增加，反應(yīng)加重，LAR發(fā)生的比例增加。加入Al(OH)3佐劑致敏后反應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)，EAR和LAR都出現(xiàn)的動物可達(dá)半數(shù)以上。如表4所示，正常對照組和OVA 10 + Al(OH)3 100、OVA 10 + Al(OH)3 gel 4組的EAR峰值和LAR峰值都有差異，兩個(gè)模型組沒有差異。兩個(gè)模型組的EAR面積、LAR持續(xù)時(shí)間、LAR面積也無明顯差異。OVA 10 + Al(OH)3 100組連續(xù)出現(xiàn)EAR和LAR的動物數(shù)為整組6只。

Fig.2 The Penh runningaverage curve of normal control group

圖2 正常對照組Penh移動平均曲線

Fig.3 The Penh runningaverage curve of OVA 10 + Al(OH)3 100 group

圖3 OVA 10 + Al(OH)3 100組Penh移動平均曲線

Tab.3The count of EAR and LAR

表3 EAR和LAR反應(yīng)次數(shù)統(tǒng)計(jì)

Tab.4The EAR and LAR of OVA 10 + Al(OH)3 100 and OVA 10 + Al(OH)3 gel 4 groups

表4 OVA 10 + Al(OH)3 100、OVA 10 + Al(OH)3 gel 4組EAR和LAR

3. 肺組織病理檢測結(jié)果

如圖4與正常對照組相比（圖4C、D），OVA 10 + Al(OH)3 100組（圖4A、B）顯示血管充血，肺組織有灶性出血，肺泡間隔增寬，肺泡腔內(nèi)有滲出，分泌物增多（箭頭所示），且以嗜酸性粒細(xì)胞為主的炎細(xì)胞也增多，提示造模成功，符合哮喘時(shí)有以嗜酸性粒細(xì)胞浸潤為主的炎癥的特點(diǎn)。

Fig.4 The HE staining ofleft lung on day 38

圖4 第38天左肺HE染色結(jié)果

1.實(shí)驗(yàn)動物

雄性SPF級挪威褐鼠，6 ~ 8周齡，體重140 ~ 150 g。

2. 模型構(gòu)建

1）抗原致敏

挪威褐鼠按OVA混合Al(OH)3干粉（10+100mg/只）致敏液于第0天（d 0）和第5天（d5）在每只動物背部選取2點(diǎn)進(jìn)行皮下注射，每點(diǎn)均注射0.2ml。

2）抗原激發(fā)過敏反應(yīng)

于致敏后第35天將挪威褐鼠一起放入霧化箱中，霧化箱放入二級生物安全柜中將5% OVA 5mL加入壓縮霧化吸入機(jī)，霧化吸入10分鐘完成激發(fā)。激發(fā)完成后立即將挪威褐鼠轉(zhuǎn)移至體積描記器中開始記錄呼吸參數(shù)，持續(xù)記錄16 h。

一、疾病概況

過敏性哮喘（以下簡稱哮喘）屬于I型超敏反應(yīng)又被稱作變態(tài)反應(yīng)，病變主要表現(xiàn)在肺支氣管，是以可逆性支氣管痙攣和氣道高反應(yīng)性為特點(diǎn)的慢性炎癥。病理表現(xiàn)為以嗜酸性粒細(xì)胞為主的炎細(xì)胞在肺組織大量浸潤，杯狀細(xì)胞增生、黏液過度分泌及氣道重塑等。近年來，世界范圍內(nèi)哮喘發(fā)病率逐年攀升，對人類健康危害極大，哮喘研究日益受到重視，

作為哮喘機(jī)理及藥物等研究的必備工具—動物模型發(fā)揮著重要的作用，模型的發(fā)展直接影響哮喘研究的進(jìn)步。過敏性哮喘發(fā)病機(jī)制即I型超敏反應(yīng)是該病模型的造模基礎(chǔ)，在此基礎(chǔ)上研究者根據(jù)研究目的選擇不同的模型動物，卵蛋白、塵螨、花粉等不同變應(yīng)原，哮喘發(fā)作、氣道高反應(yīng)性等不同階段和氣道阻力、Penh等不同指標(biāo)檢測方法及麻醉、清醒等不同動物生理狀態(tài)，構(gòu)建多種類型的模型。目前過敏性哮喘動物模型多樣化且各有利弊，合理的選擇是獲得優(yōu)秀研究成果的保證。

二、發(fā)病機(jī)制

I型超敏反應(yīng)包括致敏和激發(fā)兩個(gè)部分，致敏即機(jī)體首次接觸抗原，激發(fā)即機(jī)體第二次接觸抗原觸發(fā)的反應(yīng)。是指機(jī)體第二次接觸相同抗原后，

首先被樹突狀細(xì)胞、B細(xì)胞上的受體識別，受體與抗原特異性結(jié)合，產(chǎn)生刺激B細(xì)胞活化的第一信號，然后胞吞抗原將其內(nèi)化，并進(jìn)行加工處理，抗原降解后產(chǎn)生的抗原肽與MHCⅡ類分子結(jié)合，以MHCⅡ類分子-抗原肽復(fù)合物的形式提呈給特異性Th細(xì)胞（抗原誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞分化而來的Th2細(xì)胞）識別，Th細(xì)胞活化，表達(dá)CD40L，CD40L與B細(xì)胞表面CD40結(jié)合，向B細(xì)胞提供協(xié)同刺激信號即B細(xì)胞活化的第二信號。Th2還能分泌IL-4、IL-5、IL-6促進(jìn)B細(xì)胞活化增殖。B細(xì)胞活化后循兩條途徑分化：漿細(xì)胞和記憶細(xì)胞。漿細(xì)胞產(chǎn)生IgM，抗原誘導(dǎo)抗體向IgE轉(zhuǎn)換，Th2分泌的IL-4也誘導(dǎo)抗體向IgE轉(zhuǎn)換。IgE與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面的高親和性IgE Fc受體結(jié)合，完成致敏過程。

抗原再次進(jìn)入機(jī)體后，與致敏肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞表面上的IgE抗體結(jié)合，使膜上兩個(gè)相鄰的高親和性IgE Fc受體發(fā)生相互連接，即受體通過γ鏈C端免疫受體酪氨酸活化基序的磷酸化作用，使Syk和Fyn酪氨酸激酶活化，通過兩條途徑誘導(dǎo)靶細(xì)胞脫顆粒、釋放及合成生物活性物質(zhì)：（1）使γ異構(gòu)型磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C信號鏈活化，使胞漿內(nèi)肌球蛋白輕鏈磷酸化，從而導(dǎo)致脫顆粒、釋放組胺等生物活性介質(zhì)；（2）活化絲裂原啟動蛋白激酶信號通路，使膜磷脂膽堿分解產(chǎn)生花生四烯酸，進(jìn)而通過環(huán)氧合酶、脂氧合酶途徑合成前列腺素D2和白三烯，使烴基化磷脂分解成溶血血小板活化因子，再經(jīng)乙酰轉(zhuǎn)移酶作用生成血小板活化因子。引起支氣管平滑肌痙攣、血管通透性增強(qiáng)、黏液分泌增多和炎癥細(xì)胞募集等哮喘早期反應(yīng)，即哮喘發(fā)作時(shí)的速發(fā)相（early-phase asthmaticresponse, EAR）， EAR發(fā)生在接觸抗原數(shù)分鐘內(nèi)，一般持續(xù)1-2 h。50%以上的哮喘患者在EAR后會有遲發(fā)相（late-phase asthmaticresponse, LAR）出現(xiàn)，LAR主要是由炎癥細(xì)胞如嗜酸性粒細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等浸潤，呼吸道上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和氣道平滑肌細(xì)胞等趨化分泌炎性因子，進(jìn)而加重支氣管痙攣和粘膜水腫而使喘息增加，主要是炎癥過程，可持續(xù)近10 h甚至更久，加重氣道高反應(yīng)性，從而引發(fā)咳嗽、胸悶、呼吸困難和喘息等癥狀