Serinc2基因敲除心肌肥厚小鼠模型

目前關于serinc2蛋白主要集中于研究其作為逆轉錄病毒的抑制劑，在病毒增殖時，被包裝進入病毒顆粒中，從而削弱這些病毒感染新的細胞的能力。另外，關于serinc2能夠促進腫瘤發生的機制也越來越受到重視。一方面，目前尚無動物模型研究其與各種人類疾病的關系，因此，成功構建serinc2-KO的小鼠模型并探索serinc2蛋白在心血管疾病及其他疾病之間扮演的角色顯得尤為重要。另一方面，serinc2蛋白幫助serine整合到細胞膜上，促進膜脂的生成，可以影響膜的流動性和完整性，而這是細胞維持內穩態的關鍵。Serinc2-KO的純合子小鼠能否存活，在其身上會發生什么表型的變化都是一個待解之謎，通過構建serinc2-KO的小鼠模型，或許能幫助我們更加深入的了解serinc2家族甚至非必需氨基酸在生物過程中發揮的作用。

模型動物飼養在武漢大學人民醫院動物房SPF級動物實驗室，實驗動物使用許可證SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特點

門采用專用凈化密閉門并配備觀察窗。單向走道呈順時針走向設計。屏障系統內共有大鼠飼養室1間，小鼠飼養室3間，隔離觀察室1間，實驗準備室1間，潔物存放室1間，清洗消毒室1間。此外，屏障系統外配有監控室、機房和配電室等。

（2）設計參數

室內溫度：20～26°C；日溫差：≤4°C；相對濕度：40%～70%；換氣次數：15～20次/h；氣流速度：≤0．2m/s；壓強梯度：20～50Pa；空氣潔凈度：7級；菌落數：≤3個/皿；氨濃度：≤14mg/m3；噪聲：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；動物照度：15～20lx；晝夜明暗交替時間：12/12h。

（3）通風和空調系統

動物實驗室采用全新風中央空調通風系統。空氣經過初、中、三級過濾器后進入實驗室內環境。

（4）照明系統

一更、淋浴、二更、氣閘、清潔走道、潔物存放處、污物走道、緩沖間和清洗消毒間、動物飼養室、實驗準備間、隔離觀察室和功能實驗室等安裝有手動和自動開關，根據實際需要，調節控制室內照明燈。未啟用房間、清潔走道、潔物存放處、污物走道等在每日中午12點和晚上8點開啟紫外線燈照射1h。

（5）通訊系統

因為SPF級動物實驗室的環境和設施具有特殊要求，人員進入后不能隨意出入，而室內外的聯系又十分重要，故室內各房間均安裝內部電話機，按照房間順序編排電話號碼，各室內電話可相互連通，并均與監控室總機保持聯系，保證實驗室內外信息的及時溝通。

（6）監控系統

對SPF級動物實驗室的出入口、走道、實驗動物飼養室、功能操作室等重要位置均安裝了可作270°旋轉的攝像機，能夠及時了解設施的運行狀態；也能有效督促實驗人員執行科學的操作規程，避免人為因素造成室內環境和設施的污染；并對整個實驗期間的動物狀態和反應進行觀察，減少對動物的滋擾。

（7）供水系統

SPF級實驗動物飲用水以純凈水為宜。本實驗室采用管道供水，將處理后的純凈水用塑膠管道輸送到屏障系統內實驗準備室，設置接水槽，為實驗動物供應滅菌的飲用水和屏障系統內用水。要經常更換和清洗輸水管道，清洗籠具的用水添加適當比例的84消毒液。

（8）供電系統、警報系統和消防設施

SPF級動物實驗室要求全天候不間斷供風和供電，如果出現故障，不能及時發現和處理，就可能導致環境設施的污染、動物感染或死亡，造成嚴重后果。因此應對SPF級動物實驗室使用獨立穩定的供電系統，并配備有應急電源。在中央空調機房控制室安裝風機故障警報系統，以便及時檢修和維護，保證設施的安全運行。

（9）消毒滅菌設備

為防止外界物品進入SPF級動物實驗室時所攜帶的細菌污染室內環境和造成動物交叉感染，按照不同物品的特性，進行紫外線照射消毒、渡槽消毒液消毒或專用的機動門真空滅菌器消毒。

（10）動物飼養籠具

飼養大、小鼠的籠具聚碳酸脂材料的塑膠籠具，具有高透明、耐高壓、耐高溫、耐酸堿等特點。通用的不銹鋼籠具長、寬、高分別為40、30、20cm，適用于單籠飼養有特殊要求的實驗動物，配有底盤和食槽，確保實驗動物有充足的采食和活動空間，同時也保證室內環境的清潔。

（11）墊料的選擇和使用

在使用塑膠墊料時，墊料是大小鼠直接接觸的鋪墊物，起到吸濕、保暖和造窩的作用。墊料的好壞直接影響到大小鼠術后的恢復、生長發育和繁殖性能。目前，所使用的墊料主要有玉米秸墊料、刨花墊料。

（12）飼料配制

大小鼠的生產型飼料和維持型飼料必須嚴格按照國家標準，進行科學配制生產。每半年檢測一次飼料的微生物指標和有效營養成分指標，保證飼料的質量。

1.鑒定結果

根據PCR策略示意圖，經PCR和測序確認，29#，30#，36#小鼠為F1代雜合子小鼠。

圖1.PCR鑒定結果圖。

2. Serinc2敲低對PE誘導的新生大鼠心肌細胞肥大水平的作用

敲低Serinc2的表達，且敲低效率達到80%。與對照組相比，敲低Serinc2后，心肌肥厚標志物ANP、BNP、Myhh7顯著升高，表明敲低Serinc2基因加重了心肌肥厚水平。

圖2.在新生大鼠心肌細胞中，敲除ArmH4基因對PE所誘導的心肌肥厚水平的影響。

3. Serinc2過表達對PE誘導的新生大鼠心肌細胞肥大水平的作用

結果表明，過表達Serinc2能使serinc2過表達70倍。與對照組相比，serinc2過表達后ANP、BNP的mRNA水平顯著降低。上述實驗結果表明，在PE誘導心肌細胞肥大模型中，敲低或過表達serinc2分別加重或者減輕心肌肥大，這為心肌肥厚的治療提供了新的靶點。

圖2.在新生大鼠心肌細胞中，過表達ArmH4基因對PE所誘導的心肌肥厚水平的影響。

1. CRISPR/Cas9敲除策略：

Serinc2基因有5個轉錄本。根據Serinc2基因的結構，將 Serinc2-203基因的exon2-exon10(ENSMUST00000122374.7)轉錄本作為敲除區域。該區域包含了所有的編碼序列。破壞這個區域將導致蛋白質功能的破壞。

在本項目中，我們使用CRISPR/Cas9技術對Serinc2基因進行修飾。簡單的過程如下:sgrna在體外轉錄。Cas9和sgRNA微注射C57BL/6JGpt小鼠受精卵。移植受精卵獲得F0陽性小鼠，經PCR和測序證實。F0代陽性小鼠與C57BL/6JGpt小鼠交配獲得F1代小鼠穩定模型。

2.構建PE誘導的心肌肥大細胞模型，檢測Serinc2敲低以及過表達后心肌肥厚分子標志物水平。分別提取總RNA，通過qRT-PCR檢測心肌肥厚指標ANP、BNP、Myh6和Myh7的mRNA水平。

一、疾病概述 肥厚型心肌病 ( Hypertrophic cardiomyopathy) 是一種器質性心臟疾病，主要表現為左心室和(或)右心室及室間隔不對稱肥厚、心室腔變小、心室順應性降低。病因：肥厚型心肌病是常染色體顯性遺傳性疾病，60%～70%為家族性，30%～40%為散發性，家族性病例和散發病例、兒童病例和成年病例具有同樣的致病基因突變。臨床表現：1. 以青壯年多見、常有家族史。2. 可以無癥狀，也可以有心悸、勞力性呼吸困難、心前區悶痛、易疲勞、暈厥甚至猝死，晚期出現左心衰的表現。3. 梗阻性肥厚型心肌患者胸骨左緣可出現粗糙的收縮中晚期噴射性雜音，可伴震顫，應用洋地黃制劑、硝酸甘油、靜點異丙腎上腺素及Valsalva動作后雜音增強，反之應用β受體阻滯劑、去甲腎上腺素、下蹲時雜音減弱。有些病人聞及S3及S4心音及心尖區相對性二尖瓣關閉不全的收縮期雜音。臨床診斷：超聲心動圖提示左心室壁或（和）室間隔厚度≥15mm，排除了其他引起心肌肥厚的原因如高血壓病、風濕性心臟病二尖瓣病、先天性心臟病（房間隔、室間隔缺損）及代謝性疾病伴發心肌肥厚。二、模型背景1、Serinc2基因信息? 敲除基因名稱（NCBI號）：230779? 敲除基因NCBI網址鏈接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/230779? 敲除基因名稱：serinc2? 敲除基因Ensembl網址鏈接：http://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Transcript/Summary?db=core;g=ENSMUSG00000023232;r=4:130253495-130275218;t=ENSMUST00000122374? 方案針對的轉錄本（Ensembl號）： ENSMUST00000122374.7? 方案敲除的exon：exon 2-102、實驗動物背景信息所采用的小鼠品系為C57BL/6。來源：1921年立特(Little)用艾比·拉特洛坡(Abby Lathrop)的小鼠株，雌鼠57號與雄鼠52號交配而得C57BL1937年從C57BL分離出C57BL/6和C57BL/10兩個亞系。1985年從Olac引到中國醫學科學院實驗動物研究所。C57BL/6小鼠也被稱為C57 black 6，當然有的人也把它叫做B6，1921年被培育出來，屬于近交品系。該品系的最主要的兩個特點就是品系穩定和易于繁殖。另外C57BL/6小鼠是第一個完成基因組測序的小鼠品系，這也為它增加了不少的知名度。毛色：黑色。C57BL/6小鼠的主要用途有如下三個方面：? 作為生理學與病理學的實驗動物模型? 構建轉基因動物模型，百奧賽圖多采用背景純凈的C57BL/6小鼠進行基因敲除，保證遺傳背景上的高度穩定性和實驗數據的一致性。? 作為產生自發突變和誘發突變的同基因型小鼠的背景品系。主要特性：①乳腺腫瘤自然發生率低，化學物質難以誘發乳腺和卵巢腫瘤。②12%有眼睛缺損;雌仔鼠16.8%，雄仔鼠3%為小眼或無眼。用可的松可誘發腭裂，其發生率達20%。③對放射物質耐受力中等;補體活性高;較易誘發免疫耐受性。④對結核桿菌敏感。對鼠痘病毒有一定抵抗力。⑤干擾素產量較高。⑥嗜酒精性高，腎上腺素類脂質濃度低。對百日咳組織胺易感因子敏感。⑦常被認作"標準"的近交系，為許多突變基因提供遺傳背景。主要用途：是腫瘤學、生理學、免疫學、遺傳學研究中常用的品系。3、研究背景 Serinc2是Serinc（serine incorporate）蛋白家族的極其重要的一員，能幫助絲氨酸整合到細胞膜上,并促進細胞磷脂雙分子層膜上的磷酯酰絲氨酸和鞘磷脂等成分的生物生成,在膜脂分子生物合成過程中起關鍵調節作用。極性氨基酸絲氨酸(serine)屬于細胞內的一種非必需氨基酸,是磷脂酰絲氨酸和鞘脂的重要組成成分[1]。而serinc蛋白存在于所有的真核細胞的質膜中，和其他家族沒有氨基酸序列同源性，其具體的功能尚未研究清楚。但本身高度保守，具有多個疏水結構域，幾乎都編碼一個N端信號肽，其家族成員內部有31%~58%的同源性。Serinc作為一種重要的跨膜蛋白家族，共有5個成員，serinc1~5，其膜拓撲結構具有類似氨基酸轉運蛋白的11個跨膜區段，且均含有一個“helix-loop-helix"功能結構域[2]。 最初研究發現serinc蛋白生物學活性主要與腫瘤相關，能夠在抑制細胞凋亡的同時促進腫瘤的發生[3]。研究發現serinc1能夠阻滯肺癌細胞的周期進程，從而抑制肺癌組織的復制[4]。2003年，serinc2（又稱為tumor differentially expressed 2, 腫瘤差異表達基因2 ）蛋白首次被科學家Player發現。目前，關于serinc2的相關報道較少，Player等[5]觀察到serinc2在非小細胞肺癌中表達水平較高，并且在正常組織中serinc2不同的表達水平與細胞增殖的相對速度無關，提示serinc2在肺癌腫瘤發生的特殊作用。Zeng等[6]進一步發現serinc2在肺腺癌組織中高表達，其可能通過PI3K/AKT信號通路調控腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲。另外，染色體芯片分析發現與自閉癥發生相關的serinc2基因變異[7]。進一步通過全基因組關聯研究和meta分析發現serinc2基因變異與歐洲人群酒精成癮密切相關，并且可以作為酒精依賴風險的因素進行隨訪[8, 9]。 迄今為止尚未有研究發現serinc2與心血管疾病之間的關系，但是2015年，美國麻省大學醫學院，意大利特倫托大學和瑞士日內瓦大學的研究團隊同時在nature發表論文，揭示了serinc蛋白家族成員能夠抑制HIV（human immunodeficiency virus,人免疫缺陷病毒）病毒顆粒的復制。在HIV感染時，兩者能結合到病毒顆粒中并作為信號報警器阻止病毒的進一步增殖。參考文獻：1. Muthusamy, T., et al., Serine restriction alters sphingolipid diversity to constrain tumour growth. Nature, 2020. 586(7831): p. 790-795.2. Pye, V.E., et al., A bipartite structural organization defines the SERINC family of HIV-1 restriction factors. Nat Struct Mol Biol, 2020. 27(1): p. 78-83.3. Bossolasco, M., et al., Human TDE1, a TDE1/TMS family member, inhibits apoptosis in vitro and stimulates in vivo tumorigenesis. Oncogene, 2006. 25(33): p. 4549-58.4. Ren, W.H., et al., siRNA-mediated knockdown of hTDE2 retards cell cycle progression through transcriptional activation of p21. Oncol Rep, 2014. 31(3): p. 1314-22.5. Player, A., et al., Identification of TDE2 gene and its expression in non-small cell lung cancer. Int J Cancer, 2003. 107(2): p. 238-43.6. Zeng, Y., et al., SERINC2-knockdown inhibits proliferation, migration and invasion in lung adenocarcinoma. Oncol Lett, 2018. 16(5): p. 5916-5922.7. Hnoonual, A., et al., Chromosomal microarray analysis in a cohort of underrepresented population identifies SERINC2 as a novel candidate gene for autism spectrum disorder. Sci Rep, 2017. 7(1): p. 12096.8. Zuo, L., et al., Genome-wide association discoveries of alcohol dependence. Am J Addict, 2014. 23(6): p. 526-39.9. Zuo, L., et al., A New Genomewide Association Meta-Analysis of Alcohol Dependence. Alcohol Clin Exp Res, 2015. 39(8): p. 1388-95.