內毒素血癥IL-1R8基因敲除小鼠模型

目前對于IL-37a的研究并不深入，作為一種新型炎癥抑制因子其可能與IL-37b具有相近的功能與作用機制，IL-1R8具有顯著抑制炎癥反應的功能，已被證明為IL-37b的受體，我們的研究證明IL-1R8也是IL-37a的受體。IL-1R8基因敲除小鼠模型能夠廣泛應用于IL-37a參與調控的各種免疫或炎性癥疾病的研究。

本模型于中國醫學科學院醫學實驗動物研究所動物房構建，由遺傳中心技術人員進行相關操作，制備過程中的監督管理、處置措施、微生物菌株管理、細胞系描述、遺傳分析、對環境和生態影響的評估等均嚴格按照研究所關于動物資源制備的相關規定或措施開展。

目前對于IL-37a的研究并不深入，作為一種新型炎癥抑制因子其可能與IL-37b具有相近的功能與作用機制，IL-1R8具有顯著抑制炎癥反應的功能，已被證明為IL-37b的受體，我們的研究證明IL-1R8也是IL-37a的受體。IL-1R8基因敲除小鼠模型能夠廣泛應用于IL-37a參與調控的各種免疫或炎性癥疾病的研究。

1、基因型鑒定

2、基因表達

qPCR檢測IL-1R8基因敲除小鼠脾臟中IL-1R8 mRNA的表達。

3、表型特征

內毒素血癥

IL-1R8基因敲除小鼠在LPS誘導的致死性休克疾病中，與野生型小鼠相比較，死亡率更高。檢測其血清中相關促炎性細胞因子的表達，結果顯示，IL-1R8小鼠產生的促炎性細胞因子的表達水平更高，與其高致死率的表型相符。

1、實驗材料

（1）實驗動物

本模型構建用到的小鼠均來自于本研究所遺傳中心。實驗中涉及動物的操作程序已獲得中國醫學科學院醫學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準，批準號為GR18001。

（2）實驗儀器

（3）試劑

2、模型構建環境

中國醫學科學院醫學實驗動物研究所SPF級動物房。

3、模型構建方法

1）構建策略

CRISPR/Cas9構建方法。

2）構建sgRNA 載體pUC57-sgRNA expression vector，根據基因信息選擇靶點并合成sgRNA。

靶點1：

M-SIGIRR-gRNA-UP15’TAGGCTGTTGTACTCTTTCTGC

M-SIGIRR-gRNA-DOWN15’AAACGCAGAAAGAGTACAACAG

靶點2：

m-SIGIRR-grna-up25’taGGcttctggtaagaaggcatcc

m-SIGIRR-grna-down25’AAACGGATGCCTTCTTACCAGAAG

3）合成的sgRNA單鏈通過退火復性結合成小片段，插入BSA I線性化的載體，構建完成的sgRNA載體通過體外轉錄成為可注射的sgRNA。

4）構建Cas9載體pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，載體通過體外轉錄成為可注射的Cas9-RNA。

5）顯微注射

（1）超數排卵：15只3-4周齡C57BL/6J鼠注射激素進行超排。

（2）受精卵注射：取約150枚受精卵進行注射。

（3）雄鼠結扎：制作30只8周齡輸精管結扎的C57BL/6J鼠。

（4）受體鼠制備：8-10周齡C57BL/6J鼠與結扎的C57BL/6J鼠交配后選取見栓的雌鼠。

（5）胚胎移植：將注射后的受精卵移植到受體鼠輸卵管壺腹部（移植一次，150枚卵，5只受體鼠）。

6）基因型鑒定

（1）剪尾編號：出生7-10天的乳鼠，剪取腳趾和尾尖進行編號及取材。

（2）基因組DNA提取：使用基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA

（3）PCR檢測：根據序列信息設計檢測引物并進行PCR檢測。

7）結果分析：選取通過PCR檢測后含有不同于野生型分子量條帶的鼠號，將PCR產物進行TA克隆，之后用檢測引物進行菌液PCR，篩選有插入的克隆測序。

一、疾病概述

內毒素血癥是由于血中細菌或病灶內細菌釋放出大量內毒素至血液，或輸入大量內毒素污染的液體而引起的一種病理生理表現。內毒素血癥分為內源性和外源性兩大類。內毒素血癥臨床癥狀主要決定于宿主對內毒素的抵抗力。癥狀和體征有：發熱，白細胞數變化，出血傾向，心力衰竭、腎功能減退、肝臟損傷、神經系統癥狀，以及休克等。

二、模型背景

1、小鼠IL-1R8基因信息

IL-1R8基因位于小鼠7號染色體，又稱Sigirr（single immunoglobulin and toll-interleukin 1 receptor (TIR) domain）。屬于白介素1受體家族。

2、實驗動物背景信息

C57BL/6J

3、研究背景

目前對于IL-37a的研究并不深入，作為一種新型炎癥抑制因子其可能與IL-37b具有相近的功能與作用機制，IL-1R8已被證明為IL-37b的受體，我們的研究證明IL-1R8也是IL-37a的受體。IL-1R8基因敲除小鼠模型能夠廣泛應用于IL-37a參與調控的各種免疫或炎性癥疾病的研究。

參考文獻：

[1] 李夢媛，韋榮飛，楊星九等.全長與成熟形式IL?37b的真核表達載體的構建與研究[J].中國比較醫學雜志,2018,28（2）:59-63.

[2] 李夢媛，燕正強，韋榮飛等.IL?37b通過抑制樹突狀細胞相關的免疫應答緩解感染性休克[J].中國比較醫學雜志，2017,27(11)44-49.

[3] 李夢媛，韋榮飛，徐大模等.人IL?37b在大腸埃希菌中的表達、純化及活性鑒定[J].中國比較醫學雜志，2017，27（3）:20-24.

[4] 李夢媛，楊星九，徐大模等.IL-37對炎癥相關性疾病的抑制作用[J].中國比較醫學雜志，2015，25（12）:75-80.

[5] Nold-Petry CA et al. IL-37requires the receptors IL-18Rα and IL-1R8 (SIGIRR) to carry out itsmultifaceted anti-inflammatory program upon innate signal transduction. NatImmunol. 2015, 16(4):354-65.