條件性Enpp1-Floxp敲除小鼠模型

Enpp1基因編碼的蛋白是一種II型跨膜糖蛋白，屬于核苷焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族，最早發現于漿細胞（PC）中；在許多非淋巴組織中表達，包括軟骨、心臟、腎臟、肝臟和唾液腺，并在軟骨細胞、成骨細胞和血管平滑肌細胞中高表達；參與多種生物學途徑。對于Enpp1基因進行失活突變或基因沉默的小鼠，由于關節和椎旁韌帶過度鈣化，表現出“關節僵硬”和“踮腳走路”的表型。Enpp1突變也會導致小鼠和人類的血管鈣化，導致人類常染色體隱性低磷血癥性佝僂病(ARHR)或嬰兒期廣義動脈鈣化(GACI)。Enpp1突變模型也表現出過早老化的表型，如壽命短和動脈硬化，可應用于衰老研究。

模型動物飼養在武漢大學人民醫院動物房SPF級動物實驗室，實驗動物使用許可證SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特點

門采用專用凈化密閉門并配備觀察窗。單向走道呈順時針走向設計。屏障系統內共有大鼠飼養室1間，小鼠飼養室3間，隔離觀察室1間，實驗準備室1間，潔物存放室1間，清洗消毒室1間。此外，屏障系統外配有監控室、機房和配電室等。

（2）設計參數

室內溫度：20～26°C；日溫差：≤4°C；相對濕度：40%～70%；換氣次數：15～20次/h；氣流速度：≤0．2m/s；壓強梯度：20～50Pa；空氣潔凈度：7級；菌落數：≤3個/皿；氨濃度：≤14mg/m3；噪聲：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；動物照度：15～20lx；晝夜明暗交替時間：12/12h。

（3）通風和空調系統

動物實驗室采用全新風中央空調通風系統。空氣經過初、中、三級過濾器后進入實驗室內環境。

（4）照明系統

一更、淋浴、二更、氣閘、清潔走道、潔物存放處、污物走道、緩沖間和清洗消毒間、動物飼養室、實驗準備間、隔離觀察室和功能實驗室等安裝有手動和自動開關，根據實際需要，調節控制室內照明燈。未啟用房間、清潔走道、潔物存放處、污物走道等在每日中午12點和晚上8點開啟紫外線燈照射1h。

（5）通訊系統

因為SPF級動物實驗室的環境和設施具有特殊要求，人員進入后不能隨意出入，而室內外的聯系又十分重要，故室內各房間均安裝內部電話機，按照房間順序編排電話號碼，各室內電話可相互連通，并均與監控室總機保持聯系，保證實驗室內外信息的及時溝通。

（6）監控系統

對SPF級動物實驗室的出入口、走道、實驗動物飼養室、功能操作室等重要位置均安裝了可作270°旋轉的攝像機，能夠及時了解設施的運行狀態；也能有效督促實驗人員執行科學的操作規程，避免人為因素造成室內環境和設施的污染；并對整個實驗期間的動物狀態和反應進行觀察，減少對動物的滋擾。

（7）供水系統

SPF級實驗動物飲用水以純凈水為宜。本實驗室采用管道供水，將處理后的純凈水用塑膠管道輸送到屏障系統內實驗準備室，設置接水槽，為實驗動物供應滅菌的飲用水和屏障系統內用水。要經常更換和清洗輸水管道，清洗籠具的用水添加適當比例的84消毒液。

（8）供電系統、警報系統和消防設施

SPF級動物實驗室要求全天候不間斷供風和供電，如果出現故障，不能及時發現和處理，就可能導致環境設施的污染、動物感染或死亡，造成嚴重后果。因此應對SPF級動物實驗室使用獨立穩定的供電系統，并配備有應急電源。在中央空調機房控制室安裝風機故障警報系統，以便及時檢修和維護，保證設施的安全運行。

（9）消毒滅菌設備

為防止外界物品進入SPF級動物實驗室時所攜帶的細菌污染室內環境和造成動物交叉感染，按照不同物品的特性，進行紫外線照射消毒、渡槽消毒液消毒或專用的機動門真空滅菌器消毒。

（10）動物飼養籠具

飼養大、小鼠的籠具聚碳酸脂材料的塑膠籠具，具有高透明、耐高壓、耐高溫、耐酸堿等特點。通用的不銹鋼籠具長、寬、高分別為40、30、20cm，適用于單籠飼養有特殊要求的實驗動物，配有底盤和食槽，確保實驗動物有充足的采食和活動空間，同時也保證室內環境的清潔。

（11）墊料的選擇和使用

在使用塑膠墊料時，墊料是大小鼠直接接觸的鋪墊物，起到吸濕、保暖和造窩的作用。墊料的好壞直接影響到大小鼠術后的恢復、生長發育和繁殖性能。目前，所使用的墊料主要有玉米秸墊料、刨花墊料。

（12）飼料配制

大小鼠的生產型飼料和維持型飼料必須嚴格按照國家標準，進行科學配制生產。每半年檢測一次飼料的微生物指標和有效營養成分指標，保證飼料的質量。

條件性Enpp1-Floxp敲除小鼠雜合子采用PCR方式進行基因敲除的鑒定。

（1）引物信息：見表1

表4. 鑒定引物序列

引物不同組合檢測分析：

F1+R1引物PCR檢測L端floxp插入情況：

①純合子（f/f）：只有一條KI：225 bp帶

②雜合子（f/w）：兩條帶，一條為KI：225 bp，一條為WT：191 bp

③野生型（wt）：只有一條WT：225 bp帶

F2+R2引物PCR檢測R端floxp插入情況：

①純合子（f/f）：只有一條KI：236 bp帶

②雜合子（f/w）：兩條帶，一條為KI：236 bp，一條為WT：202 bp

③野生型（wt）：只有一條WT：202 bp帶

F+R引物PCR檢測兩端floxp插入情況：

需要測序判斷，測序引物為F(或R1)和F(或F2)

①純合子（f/f）：測序峰型為單峰，比對與Donor序列一致，插入兩個floxp序列

②雜合子（f/w）：測序峰型為雙峰，能讀出含有floxp序列的套峰

③野生型（wt）：測序峰型為單峰，比對與野生型序列一致

測序結果：將F/R 引物擴增的PCR 產物測序確認該小鼠為均為兩端準確插入floxp列的雜合子，具體見圖3。黑色箭頭代表野生型序列，紅色箭頭代表插入的序列，L端和R端測序的峰形分析，都可確認該小鼠floxp序列（ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT）準確插入指定位置。說明條件性Enpp1-floxp敲除小鼠構建成功。

L端floxp插入分析（測序引物：F）

R端flxop插入分析（測序引物：R）

圖3. F/R 引物擴增的PCR 產物測序結果

基因敲除構建設計：

低磷性佝僂病（Hypophosphatemicriskers）是兒童常見的代謝性骨病，是由于各種原因引起腎小管對磷的重吸收障礙，從而導致骨發育不良的一組腎失磷性代謝性骨病，臨床表現為低磷血癥、身材矮小、雙下肢骨骼畸形。兒童期的低磷性佝僂病多為遺傳性，包括常染色體顯性遺傳（ADHR）、常染色體隱性遺傳（ARHR）、X連鎖遺傳（XLHR）、伴高鈣尿癥的遺傳性低磷性佝僂病（HHRH）等。Enpp1基因是已確定的可導致低磷性佝僂病的基因之一，屬于常染色體隱性遺傳。嬰兒全身動脈鈣化(Generalized Arterial Calcification of Infancy，GACI)是少見的疾病，其特點是伴不規則內膜增厚的彌漫性動脈鈣化，冠狀動脈受累，通常在9個月前死亡。Enpp1基因也被證實與GACI有關。它編碼的蛋白是一種II型跨膜糖蛋白，屬于核苷焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族，最早發現于漿細胞（PC）中；在許多非淋巴組織中表達，包括軟骨、心臟、腎臟、肝臟和唾液腺，并在軟骨細胞、成骨細胞和血管平滑肌細胞中高表達；參與多種生物學途徑。首先，ENPP1蛋白具有廣泛的底物特異性，包括ATP、UTP、cAMP和2'3'-cGAMP。該酶催化5' -磷酸二酯酶鍵，主要在ATP中，生成核苷5'-單磷酸和無機焦磷酸鹽(PPi)，后者是骨形成過程中礦物結晶的抑制劑。對于Enpp1基因進行失活突變或基因沉默的小鼠，由于關節和椎旁韌帶過度鈣化，表現出“關節僵硬”和“踮腳走路”的表型。Enpp1突變也會導致小鼠和人類的血管鈣化，導致人類常染色體隱性低磷血癥性佝僂病(ARHR)或嬰兒期廣義動脈鈣化(GACI)。其次，ENPP1通過將ATP分解為AMP來介導核苷酸循環，而AMP再被5'核苷酸酶轉化為腺苷，腺苷則被自由地運輸到細胞中進行新陳代謝。ATP和腺苷都具有免疫調節功能。第三，ENPP1參與脂肪細胞分化，并在碳水化合物代謝和胰島素抵抗中發揮作用；ENPP1與胰島素受體結合，抑制下游信號通路，從而誘導胰島素抵抗和葡萄糖耐受。第四，ENPP1對于正常B細胞的發育是必不可少的，而且對于長壽漿細胞（LLPC）的發育和生存更是至關重要。Enpp1突變模型也應用于衰老研究。