Zika GZ01皮下注射感染樹(shù)鼩模型

１. 病毒滴度的變化：接種病毒后，動(dòng)物肺組織PVM?RT-PCR檢測(cè)可檢出病毒，病毒滴度在感染后３天達(dá)到高峰，并可維持至７日，隨后滴度下降。

２. 感染動(dòng)物體重較之未感染動(dòng)物體重下降，動(dòng)物多出現(xiàn)豎毛，弓背等癥狀。嚴(yán)重者體重下降，行動(dòng)出現(xiàn)遲緩，耳及尾可見(jiàn)紫紺，震顫，處于瀕死狀態(tài)。用于藥效評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)控制感染劑量，降低因感染出現(xiàn)的急性死亡（４日內(nèi)）。６~７日的死亡率可作為藥效評(píng)價(jià)的指標(biāo)。

３. 病理?yè)p傷以充血、出血、肺組織水腫以及炎細(xì)胞浸潤(rùn)為標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)測(cè)定肺間隔，以及肺通氣水平，進(jìn)而評(píng)估肺呼吸能力。

４. 炎癥因子重點(diǎn)關(guān)注IL-1β，IL-6，IL-18，MCP-1，IFN-γ等。

進(jìn)行人類(lèi)RSV 肺炎感染研究，國(guó)內(nèi)外推薦使用PVM做替代實(shí)驗(yàn)。PVM的毒株不同，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的品系不同，動(dòng)物的臨床表型也會(huì)存在差異。本模型的表型與國(guó)外進(jìn)行的模型研究表型相似，在急性期的死亡率較低，有較長(zhǎng)的臨床治療的窗口，可用于免疫治療的療效評(píng)價(jià)。

PVM為低于人間傳染病名錄三級(jí)安全風(fēng)險(xiǎn)的病原，人類(lèi)感染的風(fēng)險(xiǎn)低，但不排除對(duì)免疫功能缺陷者的致病性。

PVM是嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物必須排除的病原體，對(duì)動(dòng)物有致病性。會(huì)干擾其他實(shí)驗(yàn)研究。

鑒于此，此感染實(shí)驗(yàn)必須在BSL-2級(jí)以上的生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原學(xué)實(shí)驗(yàn)，在ABSL-2實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1、 鑒定、病原學(xué)檢查信息

使用肺組織定量PCR的方法可以進(jìn)行組織病毒滴度的評(píng)價(jià)。測(cè)定方法參考團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物PVM的核酸檢測(cè)方法》，或使用文獻(xiàn)支持的下列引物：

PVM -F 5′-GCCTGCATCAACACAGTGTGT-3′;

PVM -R 5′-GCCTGATGTGGCAGTGCTT-3′

測(cè)試需和組織內(nèi)參基因表達(dá)做均一化處理，如使用GAPDH做內(nèi)參。

表達(dá)水平的結(jié)果如下圖所示：

圖示：小鼠感染PVM７天后肺組織PVM?RNA水平（參比GAPDH做均一化處理）。

C:未感染對(duì)照，IN-C：感染對(duì)照，IN-A，IN-F：兩個(gè)處理組。

表達(dá)水平還可經(jīng)免疫組化進(jìn)行分析，使用PVM大鼠免疫血清進(jìn)行小鼠肺組織PVM免疫組化染色，和上圖對(duì)應(yīng)的示例圖如下：

小鼠感染PVM病毒后組織PVM免疫組化。

A:未感染對(duì)照，Ｂ：感染對(duì)照，Ｃ，Ｄ：兩個(gè)處理組。

2、 表型分析

３周齡BALB/c小鼠感染PVM后，可見(jiàn)體重較對(duì)照組體重下降，如下圖所示：

圖示：BALB/c ３周齡小鼠感染PVM體重變化

Control：未感染動(dòng)物；NS：生理鹽水處置感染動(dòng)物；GL：某藥物治療組。

感染動(dòng)物在感染３日后出現(xiàn)豎毛，弓背等癥狀。嚴(yán)重者體重下降，出現(xiàn)行動(dòng)遲緩，耳及尾部可見(jiàn)紫紺，震顫。如下圖所示：

3、 病理表型

動(dòng)物感染３~７日，肺組織可見(jiàn)充血水腫，組織病理可見(jiàn)肺間隔增寬，肺組織內(nèi)血管充血，出血，偶見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。如下圖所示。

實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF級(jí)BALB/c小鼠，感染癥狀等與性別無(wú)明顯關(guān)系，感染優(yōu)選３周齡小鼠。

實(shí)驗(yàn)使用毒株為ATCC來(lái)源PVM毒株（VR-25）。

實(shí)驗(yàn)環(huán)境

ABSL－２實(shí)驗(yàn)室，

使用負(fù)壓IVC飼養(yǎng)動(dòng)物

使用AII型生物安全柜更換動(dòng)物墊料，并進(jìn)行感染等操作。

實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程：

病毒擴(kuò)增：在BSL-2實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病毒擴(kuò)增，并使用TCID50法測(cè)定病毒滴度

使用1,000TCID50／只動(dòng)物進(jìn)行滴鼻感染

監(jiān)測(cè)動(dòng)物臨床表征變化

監(jiān)測(cè)動(dòng)物死亡率

動(dòng)物處理倫理：

動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)，動(dòng)物的痛苦不可避免，應(yīng)按照倫理審查確定研究的科學(xué)性，并根據(jù)研究需要減少動(dòng)物的使用。

來(lái)源文獻(xiàn)：Zika Virus Infection in Tupaia belangeri Causes Dermatological Manifestations and Confers Protection against Secondary Infection.

PMID:30728253

DOI:10.1128/JVI.01982-18