全身性Hprt基因敲除小鼠模型

常用的實驗動物一般都有對應的白變種品系，如BALB/c小鼠、SD大鼠、白化豚鼠、新西蘭大白兔等，能滿足特定實驗需求。為了更好地使西藏小型豬滿足科研實驗需求，本單位通利用CRISPR/Cas9受精卵注射法獲得了TYR基因敲除白化西藏小型豬。該方法可有效避免了體細胞核移植法所引起的胚胎發育延遲、出生后存活率低、同一細胞克隆株所獲得的性別單一等問題。此外，受精卵由胞質內注射法所獲得的F0代并不攜帶外源豬種的線粒體DNA，很好地保留了西藏小型豬的其他特性。外觀上看，白化西藏小型豬和普通西藏小型豬，除了眼睛和皮毛發顏色不一樣外，其他無太大差別。TYR基因敲除西藏小型豬，因黑色素合成障礙，導致全身皮膚和毛發呈白色，眼睛呈紅色，呈典型的白化癥狀。與野生型西藏小型豬相比，白化西藏小型豬的耳緣靜脈更加清晰，利于實驗時靜脈注射給藥。白化西藏小型豬的皮膚在進行炎癥和損傷觀察時更加清晰，且還可很方便地在其皮膚或毛發上做標記。

由于白化病為隱性遺傳病，白化個體并不攜帶野生型TYR等位基因，白化個體間交配繁殖只能生出白化個體，育種相對方便。白化突變動物通常在野生自然環境下會因長期受到太陽紫外線照射引起損傷或癌變，而容易被自然選擇淘汰。為了驗證TYR基因敲除白化西藏小型豬是否適合培育成實驗用小型豬新品系，我們對其一些常用指標進行了檢測。目前已通過TYR敲除的F0代間交配繁殖目前已獲得了F1代、F2代、F3代TYR基因敲除白化西藏小型豬。

白化西藏小型豬與普通西藏小型豬的各體尺指標之間無明顯差異，表明了白化西藏小型豬與同齡的普通西藏小型豬的體型相近，二者的生長發育速度保持一致。同時也表明了白化西藏小型豬在普通飼養環境能正常生長發育。通過分析和比較白化西藏小型豬與普通西藏小型豬的繁殖性能指標，發現它們的繁殖性能相似，說明白化小型豬在普通飼養環境下能正常繁殖，不受TYR基因失活的影響。

初步統計，發現白化西藏小型豬的血液生理指標與普通西藏小型豬的血液生理指標絕大部分無統計學差異。不過白化西藏小型豬的MCHC略高于普通西藏小型豬的MCHC。但由于動物的血液生理學指標也會因年齡、性別、營養狀況、生理狀態等而有所差異的。總體來說，白化西藏小型豬的血液生理指標與普通西藏小型豬的血液生理指標基本一致。

實驗結果表明，TYR基因功能失活的白化西藏小型豬，除了皮毛和眼睛顏色與普通正常西藏小型豬不一樣外，各項體尺指標、繁殖性能指標、血液生理和生化指標等與普通西藏小型豬的對應指標基本保持一致。TYR基因敲除白化西藏小型豬能在普通級動物飼養環境下很好地存活和繁殖。白化西藏小型豬由于皮膚和毛發白色，更利于耳緣靜脈給藥和皮膚實驗的觀察。此外也可作為白化病大動物模型進一步研究。我們認為TYR基因敲除白化西藏小型豬適合用作實驗小型豬新品系，滿足科研實驗需求。

酪氨酸酶基因敲除白化西藏小型豬是通過CRISPR/Cas9基因編輯技術敲除TYR基因而獲得的，沒有插入任何外源基因，為非轉基因動物。獲得的白化西藏小型豬由于是通過受精卵胞質注射法而制備的，不攜帶異種品系豬的線粒體DNA——母系遺傳物質，能保持品系的純正。所用的受精卵均通過手術體內沖卵獲得，沒有到屠宰場采集卵巢和卵母細胞，生物安全可控。TYR突變引起的白化為隱性性狀，可通過白化藏豬之間交配繁殖保種，得到的后代均為白化，能穩定遺傳。白化藏豬在普通實驗飼養環境能正常繁殖存活，但在野外環境會受到長時間太陽紫外線照射而引起皮膚損傷，且沒有原有保護色容易被天敵發現和捕殺，野生條件下不易存活，生物安全性高。

Hprt基因編碼的蛋白是一種轉移酶，在嘌呤核苷酸的生成過程中起著中心作用。該基因的突變會導致Lesch-Nyhan綜合征或痛風，Lesh-Nyhan綜合征是一種罕見的由HPRT基因突變引起的x連鎖隱性遺傳疾病。突變通過從頭合成和積累尿酸導致嘌呤核苷酸的過量生產，并導致神經和行為表型的可變頻譜。患者表現出與全身肌張力障礙相關的嚴重運動障礙，有時伴有舞蹈手足口病或痙攣；許多患者也有認知障礙，并表現出不尋常的危險行為傾向。Hprt缺乏也會對體細胞生長、骨髓干細胞成熟為紅細胞以及胃腸道功能產生不良影響。常見癥狀包括吞咽困難、不明原因的嘔吐、便秘和腹脹。

F0 代構建

Hprt基因編碼的蛋白是一種轉移酶，通過5-磷酸核糖基1焦磷酸轉移，催化次黃嘌呤轉化為肌苷單磷酸，鳥嘌呤轉化為鳥苷單磷酸。這種酶在嘌呤核苷酸的生成過程中起著中心作用。該基因的突變會導致Lesch-Nyhan綜合征或痛風，Lesh-Nyhan綜合征是一種罕見的由HPRT基因突變引起的x連鎖隱性遺傳疾病。突變通過從頭合成和積累尿酸導致嘌呤核苷酸的過量生產，并導致神經和行為表型的可變頻譜。患者表現出與全身肌張力障礙相關的嚴重運動障礙，有時伴有舞蹈手足口病或痙攣；許多患者也有認知障礙，并表現出不尋常的危險行為傾向。神經行為表型與基底神經節功能障礙有關，特別是多巴胺能通路。Hprt缺乏也會對體細胞生長、骨髓干細胞成熟為紅細胞以及胃腸道功能產生不良影響。常見癥狀包括吞咽困難、不明原因的嘔吐、便秘和腹脹。