慢性粒細(xì)胞白血病轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型

綜上，BCR/ABL1轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)成為首個(gè)人類(lèi)CML疾病的斑馬魚(yú)模型。利用該模型將有望揭示CML疾病更為精準(zhǔn)的發(fā)病機(jī)制及急變關(guān)鍵因子，闡明相關(guān)的信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)臨床早期診斷、預(yù)后、治療效果評(píng)價(jià)的分子標(biāo)記物或靶向基因，以此可進(jìn)行針對(duì)CML的斑馬魚(yú)活體高通量小分子篩選，Tg(hsp70:p210BCR/ABL)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)有望為治療CML的新藥篩選提供一個(gè)有價(jià)值的平臺(tái)。

圖1.pToL hsp70: p210BCR/ABL1質(zhì)粒結(jié)構(gòu)與Tg(hsp70:p210BCR/ABL1)品系證實(shí)

Tg(hsp70:p210BCR/ABL1)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)是利用已構(gòu)建好的含hsp70啟動(dòng)子以及BCR/ABL1的質(zhì)粒和Tol2轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，通過(guò)顯微注射技術(shù)于斑馬魚(yú)單細(xì)胞時(shí)期將完整的編碼序列整合到宿主基因組中，從而產(chǎn)生該轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)品系。 轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)的Tg(hsp70:p210BCR/ABL1)通過(guò)PCR得到證實(shí)。

圖2.Tg(hsp70:p210BCR/ABL1)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)BCR/ABL融合基因表達(dá)情況

在Tg(hsp70:p210BCR/ABL1)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)系中，通過(guò)熱激誘導(dǎo)BCR/ABL融合基因表達(dá)，BCR/ABL融合基因在mRNA和蛋白質(zhì)各水平表達(dá)于該轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)品系幼年時(shí)期顯著上調(diào)。說(shuō)明該轉(zhuǎn)基因品系斑馬魚(yú)通過(guò)熱激處理可以使BCR/ABL融合基因穩(wěn)定地強(qiáng)表達(dá)。

圖3.Tg(hsp70:p210BCR/ABL1)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)幼年時(shí)期髓系細(xì)胞發(fā)育

在Tg(hsp70:p210BCR/ABL1)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)系（斑馬魚(yú)CML模型）中，通過(guò)髓系細(xì)胞、紅系細(xì)胞、淋巴系細(xì)胞特異標(biāo)記基因l-plastin（lcp）、lyz、mfap4、整胚原位雜交實(shí)驗(yàn)，以及SB細(xì)胞化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，p210BCR/ABL在斑馬魚(yú)體內(nèi)表達(dá)可誘導(dǎo)l-plastin+整體髓系細(xì)胞數(shù)目增多，lyz+中性粒粒細(xì)胞數(shù)目增多、mfap4+巨噬細(xì)胞增多，但增多的巨噬細(xì)胞功能存在缺陷。p210BCR/ABL對(duì)Tg(hsp70:p210BCR/ABL1)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)胚胎造血的主要影響表現(xiàn)為髓系細(xì)胞增多。這與臨床上CML血液表型主要表現(xiàn)為粒系增生趨勢(shì)一致。

圖4.Tg(hsp70:p210BCR/ABL1)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)成年時(shí)期的血液表型

通過(guò)瑞氏-吉姆薩細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，斑馬魚(yú)CML模型成年時(shí)期血液表型主要表現(xiàn)為前體細(xì)胞、發(fā)育偏成熟的中性粒細(xì)胞（中幼粒、晚幼粒及成熟粒細(xì)胞）、單核/巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和血小板這幾類(lèi)細(xì)胞中的一類(lèi)或多類(lèi)細(xì)胞增多，與MPN血液表型類(lèi)似。

圖5. TKIs可緩解Tg(hsp70:p210BCR/ABL1)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)胚胎期的異常造血

通過(guò)lcp整胚原位雜交實(shí)驗(yàn)可發(fā)現(xiàn)，在imatinib、dasatinib和bosutinib對(duì)熱激誘導(dǎo)表達(dá)BCR/ABL的Tg(hsp70:p210BCR/AB1L)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)胚胎中l(wèi)cp+細(xì)胞數(shù)目相對(duì)安慰劑組明顯減少。我們知道TKIs藥物靶點(diǎn)為p210BCR/ABL激酶口袋結(jié)構(gòu)域，可緩解酪氨激酶活性異常升高引起的各種異常的生物學(xué)活動(dòng)。我們可以看到Tg(hsp70:p210BCR/ABL1)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)胚胎中l(wèi)cp+細(xì)胞數(shù)目相對(duì)安慰劑組明顯減少，說(shuō)明其對(duì)imatinib、dasatinib和bosutinib具有分子響應(yīng)，在一定程度上說(shuō)明了Tg(hsp70:p210BCR/ABL)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)胚胎造血異常的分子機(jī)制很有可能是由于p210BCR/ABL在Tg(hsp70:p210BCR/ABL)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)胚胎體內(nèi)表達(dá)引起酪氨酸激酶異常增高，而異常調(diào)控造血干細(xì)胞發(fā)育所致。