顳葉癲癇小鼠海人酸模型

通過EEG腦電記錄的方法評估顳葉癲癇小鼠KA模型建模效果。建模成功的小鼠具有比較頻繁的自發性癲癇發作，根據建模效果和注射位置的不同，小鼠癲癇發作情況和病理表現也有略微的不同。

顳葉癲癇小鼠KA模型是一種被廣泛應用在顳葉癲癇疾病研究中的動物模型，大量的研究表明，顳葉癲癇小鼠模型可以在一定水平上模擬人類顳葉癲癇患者地疾病進程，有助于顳葉癲癇發病機制地研究以及抗癲癇化合物地篩選。在顳葉癲癇小鼠KA模型建立過程中，最關鍵的主要有兩點：第一，保證KA在有效期內；第二，注射位點位于海馬CA區。

創新性：

本模型與以往的基于電點燃或化學點燃的模型不同，通過單側海馬注射海人酸的顳葉癲癇小鼠模型，其致癲灶僅僅局限在一側海馬內。造模成功后，單側海馬形成典型的海馬硬化病理改變。這一模型能在最大程度上模擬顳葉癲癇患者的單側海馬病變，并且具備起源于海馬的自發性癲癇放電和癲癇發作的表現，是一種良好的篩選治療難治性顳葉癲癇的小鼠模型。

動物模型制備所用野生型C57BL/6小鼠均具有檢疫合格證明。

1. KA注射后的急性癲癇發作

KA注射后5 min小鼠開始有輕微癲癇發作，如面部胡須抽動，逐漸發作為全身性的強直-陣攣性癲癇發作，進入癲癇發作急性期[6]。小鼠表現出前后肢抽搐，弓背等行為。急性期癲癇發作大概持續1-3個小時后可自行恢復。

2. 病理驗證

顳葉癲癇小鼠模型在KA注射4周后，取小鼠大腦做病理切片和免疫組化染色，可見單側海馬出現如下的改變：（1）CA1-CA3區錐體神經元出現廣泛的死亡（蘇木素染色或DAPI染色可見核固縮現象）；（2）GFAP染色可見KA注射測海馬有明顯的反應性星形膠質細胞增生；（3）蘇木素染色可見海馬齒狀回顆粒細胞出現明顯的散布。如果不具備此類病理改變，則建模失敗。

3. 腦電圖驗證

KA注射后4周后小鼠進入慢性期癲癇發作，具有穩定的自發性癲癇發作。在此階段在小鼠頭部埋置腦電記錄電極，通過EEG腦電記錄，記錄癲癇發作情況評估建模效果[7, 8]。一般來說，建模成功的小鼠在腦電記錄上表現出明顯的癲癇尖波放電，每只小鼠大概每周有3次以上的自發性癲癇發作。同步視頻記錄可以觀察到在腦電出現同步化異常放電時，小鼠出現明顯的前后肢抽搐行為。如果不具備異常腦電和癲癇發作行為，則建模失敗。

4. 公開發表的論文依據

本模型的建立工作發表論文：何婷婷等.構建海人酸誘導的內側顳葉癲癇小鼠模型.基礎醫學與臨床.2011;31(7):820-824.

應用本模型篩選得到Hsp90抑制劑17AAG可用于治療顳葉癲癇小鼠的癲癇發作，研究結果發表于知名實驗醫學期刊：Sha LZ, et al. Pharmacologic Inhibition of Hsp90 to Prevent GLT-1Degradation as an Effective Therapy for Epilepsy. Journal of ExperimentalMedicine. 2017;214(2):547-563.

實驗材料

8-10周齡雄性C57BL/6小鼠，1ng/nl KA工作液，5%水合氯醛溶液，3% H2O2，75%醫用酒精，醫用消毒棉簽，手術器械，手術縫合線，小動物立體定位注射儀，醫用小動物打孔器，一次性醫用注射器，微量注射玻璃針。

實驗環境

屏障環境，無菌操作臺。

實驗方法

1. 小鼠麻醉，一次性醫用注射器腹腔注射200 ul 5%水合氯醛（小鼠體重按照20g算），小鼠深度麻醉后（顳葉輕輕夾腳趾無反應，呼吸均勻）轉移到小動物立體定位注射儀上，固定頭部。

2. 用眼科剪剪去小鼠頭部毛發，暴露頭皮，75%醫用酒精消毒皮膚，用消毒后的鑷子從中縫位置夾起頭皮，眼科剪沿中縫靠右2 mm處剪開10 mm左右的創口，暴露顱骨。

3. 用醫用棉簽蘸取3% H2O2，輕輕擦拭顱骨表面組織；醫用棉簽蘸取75%醫用酒精擦去殘留的H2O2，醫用棉簽擦凈顱骨表面。

4. 醫用小動物打孔器按照坐標 AP=2.0 mm，ML=1.8 mm打孔，打孔后用醫用棉簽蘸取75%醫用酒精擦去骨粉。

5. 小動物立體定位注射儀安裝好微量注射玻璃針后抽取200 nl KA，按照坐標AP=2.0 mm，ML=1.8 mm，DV=2.3 mm進針，接下來開始注射，注射速度 200 nl/min。注射完成后停針2 min。2 min后收回微量注射玻璃針。

6. 使用手術縫合線縫合小鼠頭頂傷口，消毒傷口附近皮膚。注射結束后的小鼠放在舒適恒溫的環境中使其自然蘇醒，小鼠蘇醒后放回原來的籠位中，及時補充食物和飲水。

研究目的及意義

癲癇是最常見的神經系統疾病之一，據估計，全世界范圍內約有5000萬癲癇患者，每年的癲癇發生率約為240萬。我國目前約有900萬的癲癇患者，約占全世界癲癇患者總數的1/5[1-4].

部分性癲癇患者約占癲癇患者總數的60%，部分性癲癇是指癲癇的病灶位于大腦半球中的一個或者位于一側大腦半球的局部區域內[4]。顳葉癲癇是部分性癲癇的常見類型。顳葉癲癇患者中約有1/3的患者對于常見的抗癲癇藥物治療無效，這使得顳葉癲癇成了成人最難治療的癲癇類型。對于這些患者，手術切除治療是唯一的治療選擇。顳葉癲癇手術治療前需要準確定位致癲組織，手術切除時更需要完整切除致癲灶。但是由于致癲組織切除不足，仍有30%左右患者出現癲癇復發。對于無法準確定位致癲組織的癲癇患者來說，手術切除并不適合他們[1, 5]。

綜上，顳葉癲癇實驗動物模型可以為顳葉癲癇的組織病理學研究和臨床治療提供幫助。其中受到廣泛使用的就是顳葉癲癇小鼠海人酸模型。

海人酸（kainic acid, KA）是L-谷氨酸的環狀類似物以及離子型KA受體激動劑，最早從海藻中提取，當作殺蟲劑使用。KA處理神經元可以誘導強烈的去極化作用最終導致神經元的死亡，這也是顳葉癲癇主要的病理表現[6]。KA處理的嚙齒類動物最開始具有急性期癲癇發作，隨后進入4-5周的潛伏期，最終進入難治性的自發性癲癇發作階段。KA處理的嚙齒類動物會有海馬硬化相關的病理表現，包括海馬神經元丟失，顆粒細胞散布，苔狀纖維發芽等，這與顳葉癲癇患者的病理表現接近[6]。

使用顳葉癲癇小鼠海人酸模型可以很好地模擬顳葉癲癇患者地臨床表現，為顳葉癲癇發病機制的研究以及抗顳葉癲癇藥物的研發提供幫助。

國內外研究進展

Nadler等人第一批報道KA對海馬神經元有影響。這些實驗表明，在Sprague-Dawley大鼠腦室內注射KA（0.5 nmol）1-3天后導致海馬吻端CA3區錐體細胞變性，而高劑量（0.8μg）則導致海馬尾更多區域的神經元丟失[6]。高于0.8μg的劑量可以導致海馬CA1和CA2區域神經元變性。Ben-Ari等人的研究中發現杏仁核內注射KA能夠引起海馬神經退行性病變和癲癇發作行為。Cepeda等報道在狒狒杏仁核內注射KA可引起雙側海馬損傷和癲癇持續狀態（status epilepticus ,SE）。上述研究表明杏仁核和海馬內注射KA可以再現顳葉癲癇患者腦組織相關病理變化，這種動物模型可以代表顳葉癲癇模型[6]。