慢性束縛應激誘導大鼠抑郁模型

慢性束縛應激作為一種非損傷性刺激，能有效地引起典型的非特異性應激反應，且與人類身心性疾病的致病過程有相似性，是目前應用最廣泛的一種抑郁癥動物模型。與獲得性無助、不可預測性應激等慢性心理應激模型相比，是建立單純心理應激所致情緒障礙等神經精神疾病更適宜的造模方法。

研究報道，慢性應激抑郁模型會導致動物體重下降，14 h /28 d CRS 組雌雄大鼠與相應對照組比較體重顯著下降，而10 h /28 d CRS組大鼠無顯著性差異。一般認為抑郁動物的活動度減少，在陌生的環境里會減少對中央區域的探索。14 h /28 d CRS 組雌雄大鼠運動路程和時間、中央區活動路程和時間等指標顯著減少，表明其對新奇環境好感度降低，表現出抑郁癥的特征。10 h /28 d CRS僅雄性組在中央區運動時間減少。

機體獎賞系統的閾值增加，快感缺失為抑郁癥的一個主要的癥狀，糖水偏愛實驗則是目前使用最為廣泛的一個用于評價快感缺失的動物行為學測試方法，14 h/28 d CRS 組動物糖水偏愛指數顯著降低表明其具有快感缺失的抑郁樣行為，而10 h/28 d CRS組雌雄大鼠與自身糖水基線及對照組相比均無顯著性差異。

新奇事物實驗是研究動物自發探索行為的一種方法。動物在已熟悉的空場環境中面臨新奇事物時，產生既對新事物好奇又對新事物恐怖的矛盾沖突，出現接近-回避的沖突行為。抑郁動物在新奇事物實驗中的探索行為減少，14 h /28 d CRS 組的雌雄性大鼠與對照組相比探索次數、探索時間明顯下降，潛伏期時長顯著增多，表明動物對新奇環境的探究能力下降，其對事物失去興趣。10 h /28 d CRS 組僅雄性大鼠的潛伏期明顯延長，探索時間縮短。

有文獻指出慢性應激刺激對誘導雌雄大鼠抑郁樣行為敏感性不同。為證實此本實驗對雌雄鼠進行對比，發現與對照組相比，14 h/28d CRS雌雄大鼠的糖水偏愛指數及差值極顯著低于對照組。10 h /28 d CRS雄性組在中央區運動時間比對照組顯著減少，而雌性組各指標均無顯著性差異。10 h /28 d CRS組雄性大鼠的潛伏期顯著延長，探索時間明顯縮短，而對應的雌性組大鼠僅潛伏期顯著延長。這提示雄鼠可能對CRS更為敏感，更易表現出抑郁樣行為。

此外，本實驗室亦報道了慢性束縛6h/28天致使雄性Wistar大鼠表現出抑郁行為。在10h/28天束縛應激雌雄大鼠表現出一定的性別差異，雌性鼠對應激的的耐受力更強，CRS更易致雄性大鼠產生抑郁樣行為。而慢性束縛應激（14h/28天）能顯著表現出穩定的抑郁樣行為，性別差異對其無影響。故我們推薦慢性束縛應激6~14h/28天雄性大鼠均能表現出抑郁樣行為，在10h/28天束縛應激SD雌雄大鼠均表現出一定的性別差異，雌性鼠對應激的的耐受力更強。而慢性束縛應激（14h/28天）SD雌雄均表現出穩定的抑郁樣行為。由此得出連續28 d、每天束縛14 h建立的抑郁癥動物模型是一種更穩定的抑郁模型。

應激作用下會使得機體皮質酮含量升高，高皮質酮也會誘發抑郁樣行為。持續注射皮質酮會使得大鼠出現快感缺失、行為絕望等抑郁樣表現。臨床數據也顯示大部分抑郁癥患者的皮質酮水平明顯升高。本研究中發現CRS 14h/28天升高了SD血清中的皮質酮含量，而采用陽性藥西酞普蘭與應激組相比顯著降低了皮質酮水平，表明慢性束縛應激（14h/28天）可能通過升高血清皮質酮含量，提高HPA軸興奮，產生抑郁樣行為。

模型技術難點在于由于束縛器是樹脂材料的圓柱形，頂端有數個通氣的小孔，各組動物體重應控制在適宜范圍之內，滿足其在束縛器中身體不能翻轉，只能保持頭部活動保持正常呼吸。另外，在束縛早期由于動物掙扎劇烈，會出現動物窒息的情況，所以一開始需要我們24 h觀察，及時排除動物窒息死亡的情形。

與其他應激模式不同：慢性束縛應激是將動物置于無法逃脫的應激環境中，通過行為制動的方式（非損傷性刺激），能有效地引起典型的非特異性應激反應，且與人類身心性疾病的致病過程有相似性，是目前應用最廣泛的一種抑郁癥動物模型。

本實驗采用健康成年SPF級大鼠。飼料墊料均為高壓滅菌產品，購自北京維通利華實驗動物有限公司，動物用水均經過除菌處理。實驗動物以完整的包裝直接進入實驗室，觀察適應5天后無異常情況，方進行實驗。實驗過程中動物操作均符合動物倫理學規范，對環境和生態影響等符合國家相關法律規定。

1 實驗材料

（1）藥品與試劑：

鹽酸西酞普蘭 (西安楊森制藥有限公司，中國，批號為22730060)、大鼠皮質酮ELISA試劑盒(上海西唐生物科技有限公司，中國)

（2）儀器：

① 行為學檢測：空場、糖水偏愛、新奇事物探索

②蛋白含量檢測：全自動酶標儀（美國Bio-Rad公司）、超聲細胞破碎儀（美國Sonics公司）、分析天平（梅特勒托利多公司）。

2 評價方法

（1）行為學評價:

①空場：

利用自主活動實驗計算機圖像實時監測分析處理系統進行實驗，該系統由自主活動測試箱、攝像系統和圖像采集分析系統三部分組成。自主活動測試箱由4個圓柱形桶構成，攝像頭系統對測試動物進行實時檢測，并將動物的運動信息傳送給視頻卡，并通過軟件對動物的運動信息進行分析處理。將大鼠置于測試箱適應2-3min后再進行測試，測試時間為10 min，測試時保持周圍環境的安靜，點擊開始后圖像采集分析系統自動記錄各項數據。

②糖水偏愛實驗:

在造模前進行訓練和糖水偏愛測試（基線），基線測試即在大鼠禁食禁水23小時后，測定第24小時內的糖水/純水的消耗量，計算糖水偏愛指數（糖水偏愛指數=糖水消耗/總液體消耗×100%)。造模28天后，再進行一次糖水偏愛測試，觀察束縛大鼠的糖水偏愛指數的變化差異。

③新奇事物實驗：

于自主活動實驗次日將大鼠放入自主活動測試箱中測試。測試前在測試箱中央放入一個藍色的圓柱體新奇事物。實驗時將大鼠面向測試箱壁放入，并記錄10 min 內首次探索新奇事物的時間（即潛伏期，10 min內無探索行為，則潛伏期時間記為10 min）、探索次數以及探索時間。

（2）皮質酮含量的測定

大鼠斷頭取血后將血液靜止24 h，室溫下3000r /min 離心10 min，取上清， 于4℃下8000 r/min離心10 min，取上清置于－80℃冰箱保存。采用ELISA法檢測皮質酮含量，按說明書操作，利用全自動酶標儀檢測吸光度，吸光度的檢 測波長為450 nm評價結果。

（3）行為學結果

① 慢性束縛應激對大鼠體重的影響

如表1 所示，從第15 天開始，14h /28 d CRS 組雌性和雄性大鼠的體重均顯著下降(P＜0. 01) 。而10 h /28 d CRS 組雌雄性大鼠與對體重無顯著性差異。

表1 慢性束縛應激對大鼠體重的影響( n = 10，Mean±SEM)

注：與對照組相比*p<0.05；** P<0.01.

②慢性束縛應激對大鼠糖水偏愛指數的影響

如表2 所示，第1天糖水基線測試表明CRS 組雌雄性大鼠各組間的糖水偏愛指數無差異。與糖水基線比較，14 h /28 d CRS雄性組糖水偏愛指數水平明顯下降(P＜0. 01)。與對照組相比，14 h /28 d CRS 雄性組的糖水偏愛指數及差值極顯著低于對照組(P＜0. 01)。與糖水基線比較，14 h /28 d CRS 雌性組糖水偏愛指數水平明顯下降(P＜0. 05)。與對照組相比，14 h /28 d CRS 組的糖水偏愛指數差值極顯著低于對照組(P＜0. 01)。10 h /28 d CRS 組雌雄大鼠與自身糖水基線及對照組相比，均沒有顯著性差異。

表2 慢性束縛對大鼠糖水偏愛指數的影響( n = 10，Mean±SEM)

注: 與對照組相比，* P＜0. 05，**P＜0. 01。與糖水基線比較，＆P＜0. 05，＆＆P＜0. 01。

③慢性束縛應激對大鼠自主活動的影響

如表3 所示，與對照組相比，14 h /28 d CRS 組雄性大鼠的運動路程、運動時間、中央運動時間均極顯著減少(P＜0. 01)，靜息時間顯著增加( P＜0.05)。同樣，與對照組相比，14 h /28 d CRS 組雌性大鼠CRS 組的運動路程、運動時間、中央運動時間以及外周運動時間均極顯著減少(P＜0.01)，靜息時間顯著增加(P＜0. 01)。10 h /28 d CRS 雄性組大鼠除在中央區運動時間比對照組少(P＜ 0. 05)，其他指標無顯著差異。10 h /28 d CRS 雌性組的模型和對照組相比各指標均無顯著性差異。

表3 慢性束縛對大鼠自主活動的影響( n = 10，Mean±SEM)

④ 慢性束縛應激對大鼠新奇事物探索行為的影響

如表4 所示，14 h /28 d CRS 組的雌雄性大鼠與對照組相比，潛伏期顯著升高(P＜0. 01)，探索次數、探索時間明顯下降(P＜0. 01)。14 h/28 d CRS雌性組的探索時間明顯比對應雄性組長(P＜0. 05)，而14 h /28 d 雌性對照組的探索時間明顯比對應的雄性組短(P＜0. 05)。10 h /28 d CRS 雄性組大鼠的潛伏期顯著增長(P＜0. 05) ，探索時間明顯減短(P＜0. 05)。10 h /28 d CRS雌性組大鼠僅潛伏期顯著增長(P＜0. 05) ，探索次數及探索時間和對照組相比則無明顯變化。

表4 慢性束縛應激對大鼠在新奇事物實驗中探索行為的影響( n = 10，Mean±SEM)

注：與對照組相比，*P＜0. 05，**P＜0. 01。與對應雄性組相比，#P＜0. 05，##P＜0. 01。

（4）血清皮質酮檢測結果

如表5，相比于對照組，模型組的血清皮質酮含量(P＜0. 01)明顯增高，陽性藥西酞普蘭組相較于模型組動物的皮質酮水平也明顯下降(P＜0. 05)。

表 5 慢性限制活動對SD雄性大鼠皮血清皮質酮水平的影響 ( n = 15, Mean±SEM)

注：與對照組相比，**P＜0. 01；與空白組相比，#P＜0. 05

1 動物：清潔級Sprague-Dawley 大鼠，雌雄各半

2 材料：行為限制器、醫用棉簽

3 儀器：無

4 模型誘導方法：

慢性束縛組大鼠每天早上9:00開始束縛，束縛強度為6h和14h，連續束縛28天。束縛時將動物放進大鼠束縛器內（直徑 6.0 cm，長 21.0 cm），用底座固定，保持大鼠四肢固定，不能自由轉身。束縛器頂部及四周有數個孔洞，以保持束縛器內空氣流通，以防動物窒息死亡。束縛期間，模型大鼠放在臨近的隔壁房間，正常組與束縛大鼠隔開，去除束縛后再放回原來的動物籠中。

圖1 行為限制器的大鼠束縛裝置圖

抑郁癥是一種常見的神經精神疾病，患者常表現出情緒低落、消極、悲觀、內疚、注意力不集中、對事物失去興趣、睡眠和飲食障礙等特點，嚴重者甚至會產生自殺的想法[1]。據世界衛生組織報道，目前約共有3.5億名抑郁癥患者[2]。束縛應激，是一種將動物置于無法逃脫的應激環境中，通過行為制動的方式，模擬人類社會中無法避免的擁擠、壓力性空間等應激因素，是目前建立單純心理應激所致情緒障礙等神經精神疾病應用最廣泛的造模方法之一[3-5]。

文獻中關于建立該模型所使用的大小鼠品系繁多。慢性束縛應激動物模型都采用常用的模式動物, 如大鼠和小鼠。多選用封閉群 Sprague-Dawley、 Wistar大鼠、ICR小鼠、C57BL /6J小鼠等[6-9]。雄性多見。目前，文獻報道的造模時間大多在4 -8 h/day、連續14-48 d [10]。本研究在前期實驗研究和文獻調研的基礎軍隊6-14 h進行探究，本文選用10和14h，28d天觀察對雌雄大鼠抑郁行為的影響，確定該模型誘導的抑郁模型為現代人類長期處于慢性應激作用下誘發的抑郁癥機理研究、防護和藥物研究提供實驗模型。

參考文獻：

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[9] Liming Dong, Yi Wang, Jingwei Lv. Memoryenhancement of fresh ginseng on deficits induced by chronic restraint stress inmice[J]. Nutritional Neuroscience, 2017.

[10] Tatyana Buynitsky, David I. Mostofsky.Restraint stress in biobehavioral research: Recent developments. Neuroscienceand Biobehavioral Reviews. 2009,33:1089-1098.