長期高尿酸血癥慢性腎損傷樹鼩模型

該模型通過長期觀察普通狼瘡小鼠模型，待其到40周齡時(shí)，檢測其dsDNA等，結(jié)合皮膚癥狀變化，來確定慢性狼瘡皮膚病模型的建立。目前國際上尚欠缺類似模型，為研究狼瘡皮膚病發(fā)病機(jī)制提供了工具。

模型動(dòng)物飼養(yǎng)在武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物房SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特點(diǎn)

門采用專用凈化密閉門并配備觀察窗。單向走道呈順時(shí)針走向設(shè)計(jì)。屏障系統(tǒng)內(nèi)共有大鼠飼養(yǎng)室1間，小鼠飼養(yǎng)室3間，隔離觀察室1間，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室1間，潔物存放室1間，清洗消毒室1間。此外，屏障系統(tǒng)外配有監(jiān)控室、機(jī)房和配電室等。

（2）設(shè)計(jì)參數(shù)

室內(nèi)溫度：20～26°C；日溫差：≤4°C；相對(duì)濕度：40%～70%；換氣次數(shù)：15～20次/h；氣流速度：≤0．2m/s；壓強(qiáng)梯度：20～50Pa；空氣潔凈度：7級(jí)；菌落數(shù)：≤3個(gè)/皿；氨濃度：≤14mg/m3；噪聲：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；動(dòng)物照度：15～20lx；晝夜明暗交替時(shí)間：12/12h。

（3）通風(fēng)和空調(diào)系統(tǒng)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室采用全新風(fēng)中央空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)。空氣經(jīng)過初、中、三級(jí)過濾器后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室內(nèi)環(huán)境。

（4）照明系統(tǒng)

一更、淋浴、二更、氣閘、清潔走道、潔物存放處、污物走道、緩沖間和清洗消毒間、動(dòng)物飼養(yǎng)室、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備間、隔離觀察室和功能實(shí)驗(yàn)室等安裝有手動(dòng)和自動(dòng)開關(guān)，根據(jù)實(shí)際需要，調(diào)節(jié)控制室內(nèi)照明燈。未啟用房間、清潔走道、潔物存放處、污物走道等在每日中午12點(diǎn)和晚上8點(diǎn)開啟紫外線燈照射1h。

（5）通訊系統(tǒng)

因?yàn)镾PF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境和設(shè)施具有特殊要求，人員進(jìn)入后不能隨意出入，而室內(nèi)外的聯(lián)系又十分重要，故室內(nèi)各房間均安裝內(nèi)部電話機(jī)，按照房間順序編排電話號(hào)碼，各室內(nèi)電話可相互連通，并均與監(jiān)控室總機(jī)保持聯(lián)系，保證實(shí)驗(yàn)室內(nèi)外信息的及時(shí)溝通。

（6）監(jiān)控系統(tǒng)

對(duì)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的出入口、走道、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)室、功能操作室等重要位置均安裝了可作270°旋轉(zhuǎn)的攝像機(jī)，能夠及時(shí)了解設(shè)施的運(yùn)行狀態(tài)；也能有效督促實(shí)驗(yàn)人員執(zhí)行科學(xué)的操作規(guī)程，避免人為因素造成室內(nèi)環(huán)境和設(shè)施的污染；并對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間的動(dòng)物狀態(tài)和反應(yīng)進(jìn)行觀察，減少對(duì)動(dòng)物的滋擾。

（7）供水系統(tǒng)

SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲用水以純凈水為宜。本實(shí)驗(yàn)室采用管道供水，將處理后的純凈水用塑膠管道輸送到屏障系統(tǒng)內(nèi)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室，設(shè)置接水槽，為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)滅菌的飲用水和屏障系統(tǒng)內(nèi)用水。要經(jīng)常更換和清洗輸水管道，清洗籠具的用水添加適當(dāng)比例的84消毒液。

（8）供電系統(tǒng)、警報(bào)系統(tǒng)和消防設(shè)施

SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室要求全天候不間斷供風(fēng)和供電，如果出現(xiàn)故障，不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)和處理，就可能導(dǎo)致環(huán)境設(shè)施的污染、動(dòng)物感染或死亡，造成嚴(yán)重后果。因此應(yīng)對(duì)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室使用獨(dú)立穩(wěn)定的供電系統(tǒng)，并配備有應(yīng)急電源。在中央空調(diào)機(jī)房控制室安裝風(fēng)機(jī)故障警報(bào)系統(tǒng)，以便及時(shí)檢修和維護(hù)，保證設(shè)施的安全運(yùn)行。

（9）消毒滅菌設(shè)備

為防止外界物品進(jìn)入SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室時(shí)所攜帶的細(xì)菌污染室內(nèi)環(huán)境和造成動(dòng)物交叉感染，按照不同物品的特性，進(jìn)行紫外線照射消毒、渡槽消毒液消毒或?qū)Ｓ玫臋C(jī)動(dòng)門真空滅菌器消毒。

（10）動(dòng)物飼養(yǎng)籠具

飼養(yǎng)大、小鼠的籠具聚碳酸脂材料的塑膠籠具，具有高透明、耐高壓、耐高溫、耐酸堿等特點(diǎn)。通用的不銹鋼籠具長、寬、高分別為40、30、20cm，適用于單籠飼養(yǎng)有特殊要求的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，配有底盤和食槽，確保實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有充足的采食和活動(dòng)空間，同時(shí)也保證室內(nèi)環(huán)境的清潔。

（11）墊料的選擇和使用

在使用塑膠墊料時(shí)，墊料是大小鼠直接接觸的鋪墊物，起到吸濕、保暖和造窩的作用。墊料的好壞直接影響到大小鼠術(shù)后的恢復(fù)、生長發(fā)育和繁殖性能。目前，所使用的墊料主要有玉米秸墊料、刨花墊料。

（12）飼料配制

大小鼠的生產(chǎn)型飼料和維持型飼料必須嚴(yán)格按照國家標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行科學(xué)配制生產(chǎn)。每半年檢測一次飼料的微生物指標(biāo)和有效營養(yǎng)成分指標(biāo)，保證飼料的質(zhì)量。

1. 血清尿酸水平變化

給經(jīng)磷鎢酸法試劑盒檢測，樹鼩30天給藥組、120天給藥組ip注射給藥氧嗪酸鉀前后血清尿酸值均見明顯升高，120天給藥組與30天給藥組相比較給藥前后血清尿酸升高趨勢比較接近。

2. 血清肌酐水平變化

經(jīng)苦味酸比色法肌酐測試盒檢測，樹鼩30天給藥組血清肌酐含量給藥前后血清肌酐含量由73.10±18.71μmol/L變?yōu)?5.74±7.98μmol/L，幾乎沒有變化（P=0.3565>0.05）無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與對(duì)照組比較差異幾乎沒有（P>0.05）無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；120天給藥組給藥前后血清肌酐含量由62.45±14.63μmol/L升高至98.91±17.29μmol/L，（P=0.0443<0.05）有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與對(duì)照組比較有所升高，（P=0.0049<0.05）有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與30天給藥組比較有所升高。結(jié)果見表2氧嗪酸鉀致各劑量組血清肌酐變化

3. 低劑量氧嗪酸鉀對(duì)樹鼩肝臟、腎臟的病理學(xué)影響

用10％甲醛固定的樹鼩肝臟、腎臟由昆明金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所做病理切片。由病理血診斷報(bào)告結(jié)果可知120天給藥組腎小球毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血（1-5%）。部分腎小管上皮細(xì)胞空泡變性（5-10%）、水腫變性（5-10%），腎小管蛋白管 型（1-5%）。腎間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤（1-5%）。結(jié)果見圖1。

4.樹鼩對(duì)照組、30天給藥組、120天給藥組肝臟、腎臟、小腸以GAPDH為內(nèi)參基因LCN2、TGF-β、NF-κB、OAT1、OAT3基因表達(dá)水平的實(shí)時(shí)熒光定量檢測

給藥結(jié)束后，提取腎臟、肝臟、小腸RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-timefluorescence quantification，qPCR）檢測LCN2、TGF-β、NF-ΚB、OAT1、OAT3在不同組別的腎臟中mRNA的表達(dá)變化，OAT1、OAT3在樹鼩肝臟、小腸mRNA的表達(dá)變化。

結(jié)果顯示給藥組與對(duì)照組比較LCN2、TGF-β、OAT1在腎臟表達(dá)上調(diào)，OAT3、NF-κB變化不顯著，肝臟的OAT1、OAT3mRNA表達(dá)下調(diào)，小腸的OAT1、OAT3mRNA表達(dá)變化不顯著。本研究探索了LCN2、TGF-β、NF-ΚB、OAT1、OAT3基因的表達(dá)變化，為后續(xù)研究慢性高尿酸血癥所引起的肝腎損傷的分子機(jī)制打下基礎(chǔ)，建立動(dòng)物模型。

成年滇西亞種樹鼩，18只，雌雄各半，雌性體重范圍為110g~135g，雄性體重范圍為120g~150g。由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部提供，常規(guī)性飼養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境溫度20℃～25℃，濕度40%～70%，自由飲水和采食。

1. 誘導(dǎo)劑準(zhǔn)備

氧嗪酸鉀，Sigma公司產(chǎn)品，純度≥97%。溶于羧甲基纖維素鈉，制備成10mg/kg劑量。

2. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年滇西亞種樹鼩，18只，雌雄各半，雌性體重范圍為110g~135g，雄性體重范圍為120g~150g。

3. 給藥

將做過空白血清檢測的18只樹鼩隨機(jī)分成對(duì)照組、30天給藥組，120天給藥組，各6只。雌雄各半，雌性體重均在110g~135g，雄性體重均在120g~150g。對(duì)照組每日腹腔注射（iP）1％羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）40mg/kg,給藥時(shí)間為120天，給藥組以同樣劑量ip注射氧嗪酸鉀（OA），給藥時(shí)間分別為30天和120天。

4. 模型分析指標(biāo)

（1） 尿酸水平檢測

給藥最后一天空腹給藥1h后，尾靜脈采血0.8ml于1.5mlEP管中，在4℃冰箱存放1h后提取血清，4℃、13000r/min 離心15min，取血清，磷鎢酸法測定尿酸值。

（2） 肌酐水平檢測

給藥最后一天空腹給藥1h后，尾靜脈采血0.8ml于1.5mlEP管中，在4℃冰箱存放1h后提取血清，4℃、13000r/min 離心15min，取血清，苦味酸比色法肌酐測試盒檢測肌酐值。

尿酸是體內(nèi)嘌呤核苷酸的分解代謝終末產(chǎn)物，嘌呤核苷酸80%由體細(xì)胞產(chǎn)生，20%從食物中獲取。尿酸在人體內(nèi)主要通過腎臟和小腸排出體外。當(dāng)嘌呤核苷酸類食物攝入過多或者腎臟排泄尿酸的功能降低，將導(dǎo)致血尿酸濃度高于正常范圍，稱為高尿酸血癥(hyperuricem ia.HUA)。而長期高尿酸血癥會(huì)通過氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等途徑引起腎間質(zhì)纖維化和腎小球硬化，進(jìn)而導(dǎo)致腎臟發(fā)生病理性改變。研究顯示，血尿酸是腎功能異常的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,其對(duì)腎功能的影響甚至超過尿蛋白量。隨著血尿酸的升高，發(fā)生腎衰竭的概率也會(huì)大幅增高。反之，腎臟是體內(nèi)調(diào)控尿酸排泄的重要器官，所以腎損傷又會(huì)阻礙尿酸的排泄，使得血尿酸濃度進(jìn)一步升高，所以高尿酸血癥和腎功能損害是相互作用的，在臨床上表現(xiàn)為痛風(fēng)性性腎病、急性高尿酸腎病、尿酸結(jié)石等。可見研究血尿酸升高導(dǎo)腎損傷的發(fā)病因素對(duì)于治療腎損傷疾病和高尿酸血癥都至關(guān)重要。