SIVmac239直腸途徑感染恒河猴模型

1.該模型制備比較成熟，國內外都有此模型，構建和評價指標一致，所以該模型應用廣泛，具有統一的操作規程。

2. 該模型制備的關鍵：1）小鼠必須是重度免疫缺陷的，而且飼養環境必須潔凈；2）HIV操作需要生物安全。

3.此模型具有完善的人的免疫系統，HIV感染后，具有艾滋病病人相似的臨床癥狀，所以具有很高的比較醫學應用價值。

所有感染動物必須在ABSL-3室中進行。

1、 SIVmac239直腸感染恒河猴血漿病毒載量結果

SIVmac239感染10次之后，恒河猴G0101R-G0108R均已被感染，血漿病毒RNA載量和載量峰值的時間點各不相同。其中，G0103R，G0107R和G0108R這三只猴在感染后病毒載量直接到達高峰，并出現典型的疾病進程，其中G0103R第14天時達到高峰，峰值約106copies/mL，G0107R和G0108R在感染后第28天達到峰值，這三只猴的病毒載量出現相對較早；G0102R，G0104R和G0105R在感染后2-3周病毒載量呈現低拷貝復制狀態，波動在102-103 copies/mL之間，而到40天時，病毒載量才達到高峰，上升到106copies/mL；而G0101R和G0106R的病毒載量一直處于臨界值，時有時無，從未達到病毒載量的高峰。根據病毒載量的情況及變化規律（圖1）。8只恒河猴可分成三組類型：G0101R和G0106R劃分為第一組（典型疾病進展型），將G0102R，G0104R和G0105R劃分為第二組（延遲進展型），將G0103R，G0107R和G0108R劃分為第三組（隱匿型）。

圖1 SIVmac239小劑量多次直腸途徑感染中國恒河猴血漿病毒載量結果

Fig.1 The viremia (viral RNA copies/mlplasma) in Chinese-original rhesus macaques infected intrarectally withrepeated low dose of SIVmac239

SIVmac239直腸感染恒河猴外周血CD4+/CD8+比值結果

外周血中CD4+/CD8+的比例變化除G0103R在第88天時出現明顯倒置外，其余恒河猴外周血中CD4+/CD8+的比例在整個感染過程中均未出現倒置現象。G0101R和G0106R猴CD4+/CD8+的比例變化在感染后46天時呈現逐漸增加的趨勢，但到感染后第88天時，其比例又恢復到接近感染前的水平，波動在1.4-2.4之間。G0102R，G0104R和G0105R猴CD4+/CD8+的比例在感染后第7天時有所增加，隨后一直平穩維持在1.5-2.5之間，到第88天時，其比例有所下降，并出現CD4+/CD8+比例倒置現象，其比例約為0.9左右。G0103R，G0107R和G0108R猴以G0103R變化最明顯，其比例呈現逐漸下降的趨勢，到第88天時，CD4+/CD8+比例下降到0.39，其余兩只猴未出現CD4+/CD8+比例倒置現象，波動在1.1-1.3之間（圖2）。

圖2 SIVmac239小劑量多次直腸途徑感染中國恒河猴外周血CD4+/CD8+比值

Fig.2 The changes of CD4+/CD8+ ratio of T lymphocytes in Chinese-original rhesus macaques infectedintrarectally with repeated low dose of SIVmac239

1、 SIVmac239直腸感染恒河猴CD4+和CD8+細胞絕對數結果

感染猴外周血中CD4+T淋巴細胞絕對數在SIVmac239感染前后變化幅度不大，只是變化趨勢有所不同，G0101R和G0106R猴CD4+T淋巴細胞絕對數在感染第88天時略高于感染前的水平，其中以G0101R增加最顯著，由感染前的1.5×103個/uL增加到感染后第88天時的2.1×103個/uL。G0103R，G0107R和G0108R猴感染前的CD4+T淋巴細胞絕對數低于其他5只，波動在600-800個/uL之間，到感染后第14天時，有所下降，隨后有所恢復，到第88天時，CD4+T淋巴細胞絕對數略低于感染前的水平。G0102R，G0104R和G0105R猴的CD4+T淋巴細胞絕對數也同樣在感染后第14天出現下降，21天時又有所增高，但與感染前相比，到感染后第88天時，這三只猴的CD4+T淋巴細胞絕對數均略低于感染前的水平（圖3A）。

SIVmac239感染后，G0101R和G0106R猴CD8+T淋巴細胞絕對數的波動較為平穩，未出現顯著的降低或者升高的現象。G0103R，G0107R和G0108R猴CD8+T淋巴細胞絕對數的變化也相對穩定，在感染前其絕對數的水平也相對較低，但是G0103R的絕對數在第14天下降之后明顯增高，可達474個/uL，隨后一直維持在此水平上波動。G0102R，G0104R和G0105R猴的CD8+T淋巴細胞絕對數在感染后第14天時下降最為顯著，最低可達340個/uL，隨后有所恢復，到第88天時，其絕對數變化接近感染前的水平（圖3B）。

圖3SIVmac239小劑量多次直腸途徑感染恒河猴外周血CD4+和CD8+細胞絕對數變化

Fig.3 The CD4+ cell counts and CD8+ cell counts (per l blood) inChinese-original rhesus macaques infecte intrarectally with repeated low doseof SIVmac239

1、 實驗用病毒：感染毒株為SIVmac239中國恒河猴細胞適應株，使用中國恒河猴PBMCs擴增制備，CEMx174細胞滴定TCID50為3×105/mL。

2、 感染動物：選用體重4-6kg的SPF恒河猴。實驗前體檢無異常，必須排除猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆轉錄D型病毒(SRV-1，2，5)和猴T淋巴細胞性I型病毒(STLV-1)的感染。猴免疫缺陷病毒（SIV）易感性密切相關的4種基因（Mamu-A*01、Mamu-A*02、Mamu-B*08、Mamu-B*17）篩查結果為陰性。所有感染動物必須在ABSL-3室中進行。

3、 感染方法：將麻醉好的實驗猴放在操作臺上，動物采取俯臥位以保證直腸粘膜充分暴露，緩慢將SIVmac239中國恒河猴細胞適應株的稀釋液注入肛竇處，實驗猴保持此姿勢30min。

4、 SIVmac239直腸感染猴樣品采集和指標測定：用DMEM培養基稀釋成100TCID50/3mL和1000TCID50/3mL兩種濃度，采用小劑量多次直腸暴露的方式感染，3mL/只。共接種10次，2次/周。在每次感染前及10次感染結束后定期采EDTA抗凝血3ml，分別測定血常規、血漿病毒載量、CD4+/CD8+、CD4+和CD8+細胞絕對數。

5、 SIVmac239直腸感染猴血漿病毒載量的測定：提取EDTA抗凝血漿中病毒RNA，使用SYBR Green I 實時熒光定量RT-PCR方法測定血漿病毒載量。

6、 SIVmac239直腸感染猴外周血CD4+/CD8+比值及絕對數測定：CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-PE抗體標記EDTA抗凝全血淋巴細胞，流式細胞儀測定CD4+/CD8+比值，并根據血常規結果，計算出CD4+和CD8+細胞絕對數。

一、 艾滋病概述

艾滋病(AcquiredImmunodeficiency Syndrome, AIDS)，是由人免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiency Virus, HIV）引起，以全身免疫系統嚴重損害為特征的傳染性疾病，是20世紀危害人類健康和生命最嚴重的病毒性疾病之一。自美國CDC報道首例艾滋病后，到20世紀80年代中期艾滋病發展成為一個性的流行病。截止2014年底，HIV已感染3690萬人，2014年新增感染者200萬，2014年因艾滋病死亡120萬人。艾滋病在1985年傳入我國，截至2015年5月31日，歷年累計報告艾滋病530628例，其中艾滋病病人217457例，死亡167159例。艾滋病早已成為關注的公共衛生和社會熱點問題，艾滋病的預防與治療也成為當代生物醫學研究的前沿熱點之一。

二、艾滋病動物模型簡介

艾滋病發病機制研、藥物和疫苗的保護性研究及評價等方面在很大程度上依賴理想的動物模型。人們發現HIV以后，用HIV感染過多種動物，但由于種種原因，結果并不理想。研究發現猴免疫缺陷病毒(SIV)感染實驗用猴的模型效果比較理想，表現為和AIDS的臨床表征，發病過程、免疫缺陷特征等非常相似，加之HIV和SIV有一定的基因同源性，人和猴的生物學特性也較其他動物接近，因而，SIV/SAIDS(猴艾滋病)模型被廣泛接受和應用。

SIV是猴獲得性免疫缺陷綜合征（SimianImmune Deficiency Syndrome，SAIDS）的主要致病病毒，為典型的C型病毒粒子，基因組長度大約為9.2kb，基因組成同HIV-1和HIV-2基本相同，其完整的原病毒基因含有二個LTR以及同HIV類似的基因：gag、pol、vif、tat、rev、env和nef。所有基因在SIV的排列順序同HIV完全一樣。目前國內外對SIV的研究多集中在非克隆株SIVmac251和克隆株SIVmac239上，因為這兩個病毒株能在多種獼猴屬動物身上引發致死性免疫缺陷綜合征，同時伴有CD4+淋巴細胞下降，繼發機會性感染病毒性腦膜腦病。這些都與人類AIDS類似。

艾滋病的三種傳播途徑分別是經血液、性和母嬰傳播，性傳播包括同性傳播和異性傳播兩種方式。艾滋病動物模型的制備首先要考慮其實際應用價值，最好的動物模型可以最大限度的模擬人類疾病，包括使用與自然感染相同或接近的方式建立模型。為模擬同性間性傳播的感染方式，通過直腸粘膜上皮途徑感染，病毒直接感染M細胞、上皮細胞等。直腸的生理構造及上皮細胞厚度非常薄等特點，都使直腸感染較陰道感染容易發生。將病毒緩慢注入猴直腸內，可建立同性性傳播動物模型。