結核分枝桿菌感染樹鼩模型

該模型的主要評價指標為不同感染期的肺脾肝荷菌量和病變評分值，該模型與國內外報道的經典cornell模型類似，但是cronell模型的問題在于模型潛伏期荷菌量過高，復發期3-9個月后不等。本模型不斷的摸索嘗試克服以上問題，模型均一，參數指標穩定，各感染期的荷菌量值水平合適（不過低也不過高），周期明顯縮短，由3-9個月不等的周期縮短到比較穩定的10周，便于應用。

該模型不僅可以用于潛伏及復發的早期診斷分子的研究，還可以利用潛伏及復發期研究疾病機制，同時可以用于評價潛伏感染的預防性抗生素效果，以及治療性疫苗的效果。

動物模型的制備的設計得到研究所IACUC委員會的批準，人員都是訓練有素的研究人員和實驗人員，全程在ABSL-3實驗室中進行，完全按照模型制備和檢測的一系列SOP操作進行，遵守生物安全操作要求，無安全事故。

1體溫、體重、活躍度、血液學變化

各組體溫無明顯改變，低劑量組各時間段體重變化無明顯規律，活躍度改變不明顯，高劑量組1只感染后第五周病重死亡，體重降低51.52g，1只感染后八周活躍度明顯降低，體重下降40.74g，余體重變化無明顯規律，活躍度改變不明顯。

血常規檢查：高、低劑量組間血常規無明顯變化，兩組紅細胞計數、血小板計數、血紅蛋白含量無明顯變化，白細胞總數升高，淋巴細胞比例多數增高。各組血沉均<5mm/h。

2 組織荷菌量

組織勻漿細菌培養高、低劑量組間無顯著性差異，各組可見肺、肝、脾、腎、唾液腺、回腸、生殖器均有結核分支桿菌菌落生長。

3 組織切片抗酸染色

4病理改變

4.1大體病理改變

如圖3.1所示，感染后五周高劑量組病重死亡一只，體型明顯消瘦，死亡后及時解剖,胃腸組織有自溶現象，皮下、肋間隙、膈肌、后腹膜可見1-5mm大小不一的結節，腎臟肉眼可見灰白色病灶。高劑量組感染后5W、8W共有4只，低劑量組感染后8W1只靜脈注射部位有皮膚潰瘍。2只高劑量組感染后8W、11W胸腔積液約1ml，1只高劑量組感染后11W頭部皮下有膿腫。高劑量組各時間段肺組織肉眼均可見結節狀病灶。

4.2組織病理改變

低劑量組各時間段組織病理無特異性改變。

如圖3.2所示，高劑量組感染后5W病重死亡的一只脾臟內可見肉芽腫,周圍炎細胞浸潤；肝臟內炎細胞浸潤；左肺及右肺可見多個界限清楚的實變灶，中央壞死，周圍炎細胞浸潤；腎間質內灶性炎細胞浸潤；腎上腺灶性壞死，炎細胞浸潤，被膜炎細胞浸潤；真皮及皮下組織灶性壞死，炎細胞浸潤；肌肉組織灶性壞死，炎細胞浸潤（膿腫形成）；感染后5W其余動物肺組織未見特異性改變。感染后8W、11W肺組織可見大面積壞死，可見結節，結節中央壞死，周圍大量炎細胞浸潤。各時間段可見肝臟內小灶性炎細胞浸潤，腎組織內灶性炎細胞浸潤。出現皮膚潰瘍的動物，取潰瘍皮膚病檢，可見真皮及皮下組織出血壞死，炎細胞浸潤，肌肉組織大片壞死，炎細胞浸潤。感染后8W活動度明顯減少的動物，除上述肺組織特異性的改變，另可見小腦組織灶性壞死，周圍少量炎細胞浸潤。

5蛋白質譜

為了分析結核分支桿菌感染樹鼩肺組織中蛋白質表達變化，分別取高、低劑量組感染的樹鼩肺組織和正常對照組的肺組織，利用蛋白裂解液裂解后，通過iTRAQ定量質譜方法分析差異蛋白，在相對定量時，如果同一個蛋白質的量在兩個樣品間沒有顯著的變化，那么其蛋白質豐度比接近于1。當蛋白的豐度比即差異倍數達到1.5倍以上或小于0.67倍，且經統計檢驗其P-value值小于0.05時，視該蛋白為不同樣品間的差異蛋白。高劑量組（TH-A）與低劑量組（TH-B）相比篩選到的上調蛋白和下調蛋白分別為144和76個；高劑量組（TH-A）與正常對照組（TH-C）相比篩選到的上調蛋白和下調蛋白分別為134和53個；低劑量組（TH-B）與正常對照組（TH-C）相比篩選到的上調蛋白和下調蛋白分別為9和20個。高劑量組的部分表達上調的差異蛋白可能與結核感染相關，而在人類中，這些蛋白已證實與結核感染密切相關，如表3.1所示。將差異蛋白在KEGG（KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes）數據庫中進行比對，以人類相關蛋白為對照，差異蛋白參與的信號通路如下：肌動蛋白細胞骨架、吞噬、鈣離子信號通路、Jak-STAT信號通路、抗原加工及呈遞、CD45/MAPK信號通路、自噬通路，這些信號通路都與結核分支桿菌感染相關，如圖3.3所示。然而，一些已證實與結核感染有關的固有免疫相關的信號通路并未在感染結核的樹鼩模型中發現，如：Toll-like受體信號通路、NOD-like受體信號通路和Mincle/Dectin-1/DC-SIGN介導的NF-κB信號通路。

6部分差異蛋白轉錄水平的分析

選取部分與結核感染相關的差異蛋白通過qRT-PCR在mRNA水平對其進行驗證，如圖3.4所示：SHP-1、Coronin l、ASC、CD45、Cathepsin D、GSN、ITGB2、V-ATPase和STAT1表達上調，與iTRAQ結果一致；HSP90和Calnexin在mRNA水平并未上調，今后若開發有相應的抗體，可用Westernblot的方法再次驗證；接著對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，與iTRAQ和PCR結果大致一致。

綠色方塊代表高劑量組與正常對照組相比和高劑量組與低劑量組相比都差異表達的蛋白，且這些差異蛋白與結核感染相關，紅色方塊代表高劑量組與正常對照組相比和高劑量組與低劑量組相比都差異表達的蛋白，且這些差異蛋白與結核感染不相關；綠色字體代表高劑量組與正常對照組相比或高劑量組與低劑量組相比差異表達的蛋白，且這些差異蛋白與結核感染相關，紅色字體代表高劑量組與正常對照組相比或高劑量組與低劑量組相比差異表達的蛋白，且這些差異蛋白與結核感染不相關。

M代表低劑量組，S代表高劑量組，橫坐標代表蛋白名稱，縱坐標代表qRT-PCR2-ΔΔCt值

結核分支桿菌標準株H37Rv或耐藥株（內部編號94789）經小鼠體內兩次增毒，于羅氏斜面培養基培養，收獲斜面培養3周的細菌經5μm無菌濾器( Millipore公司)制成單細胞菌懸液，經羅氏斜面培養基培養計數，單細胞懸液菌濃度為1× 107 CFU /ml，單細胞懸液分裝凍存于－80℃低溫冰箱備用。

中緬樹鼩，1年齡，雄性，清潔級，體重100-170g，購自中國科學院昆明動物研究所。實驗動物的使用得到了北京協和醫學院中國醫學科學院醫學實驗動物研究所實驗動物使用和管理委員會的批準（批準號ILAC-PC-2012-003），動物在感染前一周進入醫學實驗動物研究所生物安全3級實驗室。

取樹鼩固定于保定袋中，暴露股靜脈，75%酒精擦拭消毒，靜脈注射250μl結核分支桿菌H37Rv單細胞懸液，感染劑量為2.5× 106 CFU（高劑量組），將H37Rv單細胞懸液稀釋1000倍，再靜脈注射250μl，感染劑量為2.5× 103 CFU（低劑量組），高低劑量組各感染樹鼩10只，4只為正常對照組，股靜脈注射同等體積的生理鹽水，所有實驗均在醫學實驗動物研究所生物安全3級實驗室（BSL-3）進行操作。

攻毒后每天觀察樹鼩活躍度，用紅外線體溫計監測樹鼩體溫，每周稱量一次體重。

感染后5W高劑量組取4只（其中一只病重死亡，死亡后及時解剖），低劑量組取4只，正常對照組取4只，8W高、低劑量組各取3只，11W高劑量組取3只，低劑量組取3只腹腔注射2%戊巴比妥鈉（劑量為40mg/Kg）麻醉后心臟采血處死；1.6ml血液放置血沉管中，輕柔顛倒混勻數次，垂直靜置血沉架上30分鐘后讀取1小時血沉值，約1.5ml血液放置血常規管，輕柔顛倒混勻數次，用動物血細胞分析儀檢測血常規；無菌取各組織，先后經過生理鹽水、4%硫酸和生理鹽水漂洗，進行組織病理分析、荷菌量檢測、蛋白質譜分析和部分差異蛋白轉錄水平的分析。

將采集后的各組織用4%中性甲醛固定一周后，常規方法切片、HE染色，光學顯微鏡觀察病理組織學變化。

無菌取各組織約50mg，漂洗后加1ml生理鹽水用玻璃組織研磨器研磨，組織懸液經無菌生理鹽水按照1：10稀釋后取0.1ml接種羅氏斜面培養基，平行接種3管。以上2個濃度均置于37℃，5%CO2培養箱中培養4周后進行菌落計數。

病理組織片按常規方法脫蠟后染色，將脫蠟后的組織切片置于濕盒內，滴上抗酸初染液，90℃水浴5分鐘后用細流水傾斜沖洗玻片至初染液洗掉后再滴上復染液脫色復染，直至玻片上的組織呈淡藍色；鏡檢。

將高劑量組、低劑量組、正常對照組三組肺組織樣品于沸水中5分鐘滅活結核分支桿菌。送公司進行蛋白樣品的裂解、濃度測定，蛋白酶解后用iTRAQ標記各組肽段混合，用SCX柱進行液相分離。基于Triple TOF 5600進行LC-ESI-MS/MS質譜分析。基于NCBI樹鼩核酸序列數據庫（50461 sequences），利用蛋白質鑒定軟件Mascot2.3.02進行檢索，選擇已經建好的數據庫，進行數據庫的搜索，并對質譜質量進行評估。獲得的數據進行蛋白質生物信息學分析，包括差異蛋白的篩選，進行GO、COG注釋，差異蛋白GeneOntology富集分析、pathway富集分析，以及多樣品間表達模式聚類分析。隨機選取部分差異蛋白，用SYBR-Green的熒光定量PCR進行轉錄水平的分子驗證。即從ITRAQ篩選的差異表達基因中選擇一部分與結核感染相關的基因進行qRT-PCR驗證。

結核病是由結核分支桿菌（結核菌）引起的一種慢性傳染性疾病，結核感染通常會累及肺、淋巴系統及其它多組織器官。除少數發病急促外，臨床上多呈慢性過程。常有低熱、乏力等全身癥狀和咳嗽、咯血等呼吸系統表現。感染后潛伏期4～8周，其中80%發生在肺部，其他部位（頸淋巴、腦膜、腹膜、腸、皮膚、骨骼）也可繼發感染。

排菌的肺結核患者是傳染源,人與人之間呼吸道傳播是本病傳染的主要方式。大多數的受感染者沒有病癥，稱為潛伏結核感染（latentTBinfection），但其中約5-10%的潛伏感染者會發展至活動性結核；若無適當治療，一個活動病例平均每年可使10～15人新受感染，病例本人的死亡率則超過50%。若潛伏感染者同時罹患免疫抑制，如愛滋病，每年就有10%的病發機率。

肺結核病程較復雜，臨床分型有：1、原發型肺結核(Ⅰ型):肺內滲出病變、淋巴管炎和肺門淋巴結腫大的啞鈴狀改變的原發綜合征。兒童多見，僅表現為肺門和縱隔淋巴結腫大。 2、血型播散型肺結核(Ⅱ型):包括急性血型播散型肺結核及亞急性、慢性血型播散型肺結核。 3、繼發型肺結核(Ⅲ型):可以出現以增殖為主、浸潤為主、干酪病變為主或以空洞為主等多種病理改變。

結核菌進入機體后，被巨噬細胞吞噬，結核菌毒力與宿主免疫力的抗衡決定著結核發病、發展和轉歸。結核病從感染、發病到轉歸均與多數細菌性疾病有顯著不同，宿主反應具有特殊意義，反應分為4期：1.起始期，入侵呼吸道的結核菌被肺泡巨噬細胞吞噬。因菌量、毒力和巨噬細胞非特異性殺菌能力的不同，被吞噬結核菌的命運各異。2. T細胞反應期，由T細胞介導的細胞免疫（CMI）和遲發性過敏反應（DTH）在此期形成，從而對結核病發病、演變及轉歸產生決定性影響。3.共生期，大部分感染者結核菌可以持續存活，細菌與宿主處于共生狀態。纖維包裹的壞死灶干酪樣中央部位被認為是結核桿菌持續存在的主要場所。低氧、低PH和抑制性脂肪酸的存在使細菌不能增殖。宿主的免疫機制亦是抑制細菌增殖的重要因素，倘若免疫損害便可引起受抑制結核菌的重新活動和增殖。4.細胞外增殖和傳播期，固體干酪灶中包含具有生長能力、但不繁殖的結核菌。干酪灶一旦液化便給細菌增殖提供了理想環境。即使免疫功能健全的宿主，從液化干酪灶釋放的大量結核桿菌亦足以突破局部免疫防御機制，引起播散。

結核病的全身癥狀是全身乏力、午后低熱、盜汗、食欲不振、消瘦等；呼吸道癥狀是咳嗽、咳痰、咯血、胸疼、呼吸困難等。其特征性病理改變是肉芽腫病變和結核性結節，其基本病理變化為滲出性病變、增生性病變和壞死性病變。滲出性病變以炎癥細胞、單核細胞肌纖維蛋白為主要成分，增殖性改變以結核結節及結合性肉芽腫為主，壞死的特征性改變為干酪樣改變。結核性炎癥的主要特是上皮樣細胞結節及郎格漢斯細胞。實驗室痰培養為菌陽性，抗酸染色可見細長略彎曲的桿菌，血沉加快。肺的原發病灶、淋巴管炎和肺門淋巴結結核合稱為原發綜合癥，X線影像學上的典型表現為啞鈴狀陰影。感染3-8周后結核菌素皮試轉陽，95%的健康感染者原發綜合征自然消退，成為潛伏感染人群，約5%在日后因潛在感染復燃而發病,結核病起病緩慢，病程較長。