結核分枝桿菌感染小鼠模型

該模型的主要評價指標為不同感染期的肺脾肝荷菌量和病變評分值，該模型與國內外報道的經典cornell模型類似，但是cronell模型的問題在于模型潛伏期荷菌量過高，復發期3-9個月后不等。本模型不斷的摸索嘗試克服以上問題，模型均一，參數指標穩定，各感染期的荷菌量值水平合適（不過低也不過高），周期明顯縮短，由3-9個月不等的周期縮短到比較穩定的10周，便于應用。

該模型不僅可以用于潛伏及復發的早期診斷分子的研究，還可以利用潛伏及復發期研究疾病機制，同時可以用于評價潛伏感染的預防性抗生素效果，以及治療性疫苗的效果。

動物模型的制備的設計得到研究所IACUC委員會的批準，人員都是訓練有素的研究人員和實驗人員，全程在ABSL-3實驗室中進行，完全按照模型制備和檢測的一系列SOP操作進行，遵守生物安全操作要求，無安全事故。

1小鼠體重的變化結果

根據十周連續觀察體重后，統計數據可以看出三個實驗組中的對照組小鼠體重按照正常的規律增加，即從實驗開始的18~20g到感染第10周后的21~22g左右；實驗感染小鼠的體重均有不同程度的下降。

感染途徑的不同體重變化的情況隨之不同，C57BL/J小鼠尾靜脈注射組和腹腔注射組的體重均在感染后第7周開始下降，其中尾靜脈注射下降幅度較大。BALB/c小鼠體重下降是從感染后第6周開始下降。

感染劑量的不同體重變化也有較大的變化，感染劑量為105CFU的小鼠體重變化，C57/BL/J是尾靜脈感染后第7周開始有明顯下降（約3g左右），C57/BL/J是腹腔感染后體重下降的幅度較小在1g左右，BALB/c小鼠體重下降是從感染后第6周開始下降。感染劑量為104CFU、103CFU體重還是在上升，與對照組比較沒有明顯區別。

體重變換曲線見圖1、2：

圖1 C57BL/6小鼠尾靜脈注射感染結核分支桿菌后體重變化曲線

圖2BALB/c小鼠尾靜脈注射感染結核分支桿菌后體重變化曲線

2 小鼠感染后大體病理變化

感染后6周解剖時病理變化，與對照組相比，各組小鼠的脾臟肺臟均沒有眼觀變化。

小鼠在感染8周時，不同品系小鼠和不同劑量組的小鼠在肺臟和脾臟均有不同程度的眼觀病理變化。解剖發現主要在肺臟有不同程度秫米大小的結核病灶，且脾臟腫大。小鼠感染8周后解剖病理變化：BABL/c和C57BK/J對照組小鼠均未發現肉眼可見的病理變化。BABL/c和C57BK/J小鼠的尾靜脈注射組均有肉眼可見病變灶。C57BK/J小鼠的腹腔注射組沒有肉眼可見的病理變化。8周時，與對照組相比，BABL/c小鼠的低劑量組103、104、105肺臟均已經有病理變化，脾臟出現腫大;C57BK/J小鼠低劑量組沒有變化，104、105肺臟均有病理變化，且脾臟沒有變化。

小鼠感染10周后解剖病理變化：BABL/c和C57BK/J對照組小鼠均未發現肉眼可見的病理變化。與對照組相比，BABL/c和C57BK/J小鼠的尾靜脈注射組103、104、105均有肉眼可見病變灶。C57BL/J小鼠的腹腔注射組在10周時也出現了肉眼可見的病理變化。10周時，與對照組相比，BABL/c小鼠的103、104、105各劑量組肺臟均已經有嚴重的病理變化，有粟粒樣結核結節且主要特點是分布在全肺不同的部位，脾臟出現腫大也是一個主要的病理變化指標；C57BL/J小鼠103、104、105肺臟也均出現了病理變化，也有粟粒樣結核結節，但主要分布在肺葉的邊緣。脾臟與對照組相比，沒有明顯的變化。

結果見圖3、4：

圖3 對照組小鼠解剖眼觀肺臟病理變化

CW:c57小鼠BW:BABL/c

圖4C57BL/6小鼠尾靜脈注射感染結核分支桿菌后解剖眼觀肺臟病理變化

3小鼠的組織病理變化

正常對照組的肺臟和脾臟未見明顯病理改變。10^{4CFU、105CFU、106CFU組內均有不同程度肺組織內血管旁淋巴細胞浸潤，肺組織內肉芽腫，脾臟肉芽腫，肝組織內肉芽腫。結果見圖5}

圖5 小鼠病理切片HE染色結果

A:正常肺臟；E:正常脾臟；B:肺組織內血管旁淋巴細胞浸潤 C: 肺組織內肉芽腫；F: 脾臟肉芽腫；G: 肝組織內肉芽腫

4 小鼠荷菌量變化

感染后6周時，解剖小鼠肉眼觀察，脾臟、肺臟均沒有明顯肉眼可見的病變灶。每組的正常對照組均無結核分支桿菌生長，對照組實驗結果成立。6周解剖脾臟細菌分離培養均有結果（除去C57BL/J小鼠腹腔注射104有一只為陰性）。證明以103為感染劑量尾靜脈注射均可在6周時感染BABL/c、C57BL/J小鼠。脾臟細菌分離培養結果見下表1：

感染后8周時，解剖后對照組小鼠肉眼觀察，脾臟、肺臟均沒有明顯肉眼可見的病變灶，每組的正常對照組均無結核分支桿菌生長，對照組實驗結果成立。但8周解剖時，在C57BL/J尾靜脈注射組104、105組已經在肺臟和脾臟出現眼觀的病理變化，BABL/c小鼠尾靜脈注射組103、104和105組均在肺臟和脾臟出現眼觀的病理變化。但8周解剖脾臟細菌分離培養均有結果（除去BABL/c小鼠尾靜脈注射104和C57BL/J腹腔注射組103各有一只為陰性）。證明以103為感染劑量尾靜脈注射均可在8周時感染BABL/c、C57BL/J小鼠，腹腔注射可感染BABL/c小鼠。細菌分離培養顯示組織荷菌量高于6周。

感染后10周時，解剖后對照組小鼠肉眼觀察，脾臟、肺臟均沒有肉眼可見的病變灶，每組的正常對照組均無結核分支桿菌生長，對照組實驗結果成立。在C57BL/J尾靜脈注射組104、105、106組已經在肺臟和脾臟出現眼觀的病理變化，BABL/c小鼠尾靜脈注射組104和105、106組均在肺臟和脾臟出現眼觀的病理變化，C57BL/J腹腔注射組104、105、106組已經在肺臟和脾臟出現眼觀的病理變化。細菌分離培養結果顯示組織荷菌量高于8周。

表1 小鼠感染結核分支桿菌后6周脾臟細菌的分離培養結果

1實驗用小鼠的選擇：

選擇年齡6~8周齡，體重16~20g，SPF級雌性C57BL/6和BALB/c小鼠（提供廠商:中國醫學科學院實驗動物研究所）。動物使用申請號:中國醫學科學院實驗動物研究所實驗動物管理委員會（批準號：MC—09-2003）。

2飼養環境：

動物生物安全3級實驗室（ABSL-3）；溫濕度范圍：18-28℃；相對濕度：40-70％；換氣次數：機械送排風；明暗周期：12h/12h；照度：150-300Lux；清潔消毒：用具、籠架等在投入使用前進行消毒；籠具種類及飼育密度：小鼠籠，12只一籠；

3飼養條件

中國醫學科學院實驗動物研究所華阜康有限公司小鼠專用飼料,自由采食；墊料為中國醫學科學院實驗動物研究所華阜康有限公司，定期更換；飲水；普通自來水經過高壓(121℃,30min)，自由飲用。

4實驗用小鼠的分組及感染

實驗共分為三個大組，第一組為C57BL/6尾靜脈注射組、第二組為C57BL/6腹腔注射組和第三組為BALB/c尾靜脈注射組，其中每一個大組中分四個小組：正常對照組(生理鹽水)、高劑量組（1X10^{6CFU）、中劑量組（1X105 CFU）和低劑量組（1X104 CFU），每組12只小鼠，共144只小鼠。}

5感染用菌株

用結核分支桿菌標準菌株H37Rv株或結核耐藥株（內部編號94789）。

6觀察

小鼠在進入ABSL-3實驗室之后,觀察4~5天后,進行感染實驗。感染后，觀察每天感染小鼠的臨床癥狀，并每周稱取小鼠體重，觀察不同感染方式和不同感染劑量小鼠體重的變化規律。

7病理檢查和組織荷菌量計數

分別在感染后6周、8周和10周，每組解剖3只小鼠，分別無菌取小鼠1/2脾臟、1/2肺臟，無菌研磨后接種L-J斜面進行結核分支桿菌的分離培養。并將同一組織的剩余部分固定在10%福爾馬林中，進行病理切片。

結核病是由結核分支桿菌（結核菌）引起的一種慢性傳染性疾病，結核感染通常會累及肺、淋巴系統及其它多組織器官。除少數發病急促外，臨床上多呈慢性過程。常有低熱、乏力等全身癥狀和咳嗽、咯血等呼吸系統表現。感染后潛伏期4～8周，其中80%發生在肺部，其他部位（頸淋巴、腦膜、腹膜、腸、皮膚、骨骼）也可繼發感染。

排菌的肺結核患者是傳染源,人與人之間呼吸道傳播是本病傳染的主要方式。大多數的受感染者沒有病癥，稱為潛伏結核感（latentTBinfection），但其中約5-10%的潛伏感染者會發展至活動性結核；若無適當治療，一個活動病例平均每年可使10～15人新受感染，病例本人的死亡率則超過50%。若潛伏感染者同時罹患免疫抑制，如艾滋病，每年就有10%的病發機率。

肺結核病程較復雜，臨床分型有：1、原發型肺結核(Ⅰ型): 肺內滲出病變、淋巴管炎和肺門淋巴結腫大的啞鈴狀改變的原發綜合征。兒童多見，僅表現為肺門和縱隔淋巴結腫大。 2、血型播散型肺結核(Ⅱ型):包括急性血型播散型肺結核及亞急性、慢性血型播散型肺結核。 3、繼發型肺結核(Ⅲ型):可以出現以增殖為主、浸潤為主、干酪病變為主或以空洞為主等多種病理改變。

結核菌進入機體后，被巨噬細胞吞噬，結核菌毒力與宿主免疫力的抗衡決定著結核發病、發展和轉歸。結核病從感染、發病到轉歸均與多數細菌性疾病有顯著不同，宿主反應具有特殊意義，反應分為4期：1.起始期，入侵呼吸道的結核菌被肺泡巨噬細胞吞噬。因菌量、毒力和巨噬細胞非特異性殺菌能力的不同，被吞噬結核菌的命運各異。2.T細胞反應期，由T細胞介導的細胞免疫（CMI）和遲發性過敏反應（DTH）在此期形成，從而對結核病發病、演變及轉歸產生決定性影響。3.共生期，大部分感染者結核菌可以持續存活，細菌與宿主處于共生狀態。纖維包裹的壞死灶干酪樣中央部位被認為是結核桿菌持續存在的主要場所。低氧、低PH和抑制性脂肪酸的存在使細菌不能增殖。宿主的免疫機制亦是抑制細菌增殖的重要因素，倘若免疫損害便可引起受抑制結核菌的重新活動和增殖。4.細胞外增殖和傳播期，固體干酪灶中包含具有生長能力、但不繁殖的結核菌。干酪灶一旦液化便給細菌增殖提供了理想環境。即使免疫功能健全的宿主，從液化干酪灶釋放的大量結核桿菌亦足以突破局部免疫防御機制，引起播散。

結核病的全身癥狀是全身乏力、午后低熱、盜汗、食欲不振、消瘦等；呼吸道癥狀是咳嗽、咳痰、咯血、胸疼、呼吸困難等。其特征性病理改變是肉芽腫病變和結核性結節，其基本病理變化為滲出性病變、增生性病變和壞死性病變。滲出性病變以炎癥細胞、單核細胞肌纖維蛋白為主要成分，增殖性改變以結核結節及結合性肉芽腫為主，壞死的特征性改變為干酪樣改變。結核性炎癥的主要特是上皮樣細胞結節及郎格漢斯細胞。實驗室痰培養為菌陽性，抗酸染色可見細長略彎曲的桿菌，血沉加快。肺的原發病灶、淋巴管炎和肺門淋巴結結核合稱為原發綜合癥，X線影像學上的典型表現為啞鈴狀陰影。感染3-8周后結核菌素皮試轉陽，95%的健康感染者原發綜合征自然消退，成為潛伏感染人群，約5%在日后因潛在感染復燃而發病,結核病起病緩慢，病程較長。