D173L轉基因原發性高血壓小鼠模型

動物癥狀觀察：

表現為體重減輕、弓背豎毛，在回輸后的一個月后死亡。

實驗中涉及動物的操作程序已經得到中國醫學科學院醫學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準(ILAS-GC-2012-001)。

1.多巴胺D5受體D5F173L轉基因小鼠血壓值

分別測量D5F173L、D5S390G和hD5WT小鼠以及陰性對照小鼠血壓值，組間比較結果顯示：D5F173L轉基因小鼠三至六月齡收縮壓、舒張壓和平均動脈壓都明顯高于hD5WT轉基因小鼠及非轉基因小鼠(* P<0.05 vs. D5WT, 陰性對照, n=6，t test) 。

圖1.D5F173L、D5S390G和D5WT轉基因及非轉基因對照四個實驗組小鼠三月齡至六月齡收縮壓、舒張壓及平均動脈壓比較.

1.2 比較各組小鼠收縮壓，舒張壓及平均壓隨時間變化情況（三月齡至六月齡），分析結果顯示：各組小鼠隨月齡增加收縮壓差異無顯著性變化(* P>0.05 ,n=6，t test)； D5F173L轉基因小鼠舒張壓隨年齡增加呈有上升趨勢，且四月齡較三月齡比較有顯著性差異(*P<0.05 ,n=6，t test)，其他各組轉基因小鼠舒張壓無明顯變化(*P>0.05 ,n=6，t test)；D5F173L轉基因小鼠平均壓隨年齡增加有上升趨勢，但各月齡間無顯著性差異 (* P>0.05,n=6，t test)，其他各組轉基因小鼠平均壓無明顯變化趨勢(* P>0.05,n=6，t test)。

圖2 四組小鼠的收縮壓，舒張壓及平均壓隨月齡變化分析（三月齡至六月齡）

A：各組基因小鼠及陰性對照小鼠三月齡至六月齡收縮壓比較

B：各組基因小鼠及陰性對照小鼠三月齡至六月齡舒張壓比較

C：各組基因小鼠及陰性對照小鼠三月齡至六月齡平均壓比較

2.心臟超聲結果

2.1 心臟超聲，主動脈瓣血流多普勒頻譜圖像:顯示小鼠左心室結構，獲得左心室運動曲線，主動脈瓣血流頻譜圖像。

圖3 左室M超，主動脈瓣血流及組織多普勒頻譜圖像

A: M超顯示左室長軸乳頭肌水平左室運動曲線

B: M超顯示左室短軸乳頭肌水平左室運動曲線脈沖

C: 多普勒測定的主動脈瓣血流頻譜

2.2 左心室內體積分析顯示：D5F173L轉基因小鼠舒張末期和收縮末期左室內體積均明顯低于hD5WT轉基因小鼠及非轉基因小鼠 (* P<0.01 vs D5WT, 陰性對照, n=6，t test)，提示多巴胺D5突變基因173L(D5F173L)轉基因小鼠血壓升高后可引起心臟繼發性左心室室腔增大。

圖4 四月齡至六月齡多巴胺D5突變基因F173L(D5F173L), S390G(D5S390G)及正常人D5基因(hD5WT)（對照）轉基因小鼠舒張末期和收縮末期左室內體積比較：

A:四個實驗組小鼠四月齡舒張末期和收縮末期左室內體積比較。

B:四個實驗組小鼠五月齡舒張末期和收縮末期左室內體積比較。

C:四個實驗組小鼠六月齡舒張末期和收縮末期左室內體積比較。

2.3 舒張末期左室內徑，左室前后壁及左室收縮功能相關性分析顯示：

a）左室內徑變化：四到六月齡D5F173L轉基因小鼠舒張末期左室內徑均明顯低于hD5WT轉基因小鼠及非轉基因小鼠(* P<0.01 vs. hD5WT, 陰性對照, n=6，t test)；

b)左室前壁變化：D5F173L轉基因小鼠舒張末期左室前壁與hD5WT轉基因小鼠及非轉基因小鼠相比四月齡無顯著性變化，五月齡及六月齡明顯高于hD5WT轉基因小鼠及非轉基因小鼠 (* P<0.05 vs. hD5WT, 陰性對照, n=6，t test)；

c)左室后壁變化：四到六月齡D5F173L轉基因小鼠舒張末期左室后壁均明顯高于hD5WT轉基因小鼠及非轉基因小鼠 (* P<0.01 vs. hD5WT, 陰性對照, n=6，t test)；

d）D5F173L轉基因小鼠舒張末期左室內體積與左室內徑隨月齡的增加均呈顯著性減小的趨勢且具有統計學意義（P<0.05，n=6，t test），同時其舒張末期左室前后壁厚度則呈顯著性增加。

圖5 四月齡至六月齡多巴胺D5突變基因F 173L (D 5F 173L ),S 390G (D5S 390G )及正常人D5基因(hD5WT)（對照）轉基因小鼠舒張末期左室內徑，左室前后壁厚度比較：

A:四個實驗組小鼠四月齡舒張末期左室內徑及左室前后壁比較。

B:四個實驗組小鼠五月齡收縮末期左室內徑及左室前后壁比較。

C:四個實驗組小鼠六月齡舒張末期左室內徑及左室前后壁比較。

圖6 四個實驗組小鼠舒張末期左心室相關參數隨年齡的變化：

A:四個實驗組小鼠舒張末期左室內體積隨月齡增加的比較。

B:四個實驗組小鼠舒張末期左室內徑隨月齡增加的比較。

C:四個實驗組小鼠舒張末期左室前壁隨月齡增加的比較。

D:四個實驗組小鼠舒張末期左室后壁隨月齡增加的比較。

2.4 收縮末期左室內徑，左室前后壁及左室收縮功能相關性分析顯示：

a)內徑變化：四到六月齡D5F173L轉基因小鼠收縮末期左室內徑均明顯低于hD5WT轉基因小鼠及非轉基因小鼠 (* P<0.01 vs. hD5WT, 陰性對照, n=6，t test)；

b)前壁變化：D5F173L轉基因小鼠收縮末期左室前壁與hD5WT轉基因小鼠及非轉基因小鼠相比四月齡無顯著性變化 (* P>0.05 vs. hD5WT, 陰性對照, n=6，t test)；五月齡及六月齡D5F173L轉基因小鼠收縮末期左室前壁均明顯高于hD5WT轉基因小鼠及非轉基因小鼠 (* P<0.01 vs. hD5WT, 陰性對照, n=6，t test)；

c)后壁變化：四到六月齡D5F173L轉基因小鼠收縮末期左室后壁均明顯高于hD5WT轉基因小鼠及非轉基因小鼠 (* P<0.01 vs. hD5WT, 陰性對照, n=6，t test)；

d) D5F173L轉基因小鼠收縮末期左心室內體積與左心室內徑隨月齡的增加顯著減小（P<0.05，n=6，t test），收縮末期左室前后壁厚度顯著性增加（P<0.05，n=6，t test）；其余三組小鼠收縮末期左室內體積、左室內徑及左室前后壁隨月齡有變化趨勢但無顯著性差異（P>0.05，n=6，t test）。

圖7 四月齡至六月齡多巴胺D5突變基因F 173L (D 5F 173L ),S 390G (D5S 390G )及正常人D5基因(hD5WT)（對照）轉基因小鼠收縮末期左室內徑，左室前后壁厚度比較

A:四個實驗組小鼠四月齡收縮末期左室內徑及左室前后壁比較。

B:四個實驗組小鼠五月齡收縮末期左室內徑及前后壁比較。

C:四個實驗組小鼠六月齡收縮末期左室內徑及前后壁比較。

圖8 四組小鼠舒張末期左室內相關參數隨月齡的變化：

A:四個實驗組小鼠舒張末期左室內體積隨月齡增加的比較。

B:四個實驗組小鼠舒張末期左室內徑隨月齡增加的比較。

C:四個實驗組小鼠舒張末期左室前壁隨月齡增加的比較。

D:四個實驗組小鼠舒張末期左室后壁隨月齡增加的比較。

2.5 左心室縮短分數分析顯示： D 5F 173L 轉基因小鼠左心室縮短分數四至六月齡均明顯高于hD5WT轉基因小鼠及非轉基因小鼠，且隨月齡增加差異顯著性增加(* P<0.01 vs. D5WT, 陰性對照, n=6，t test) 。

圖9 多巴胺D5突變基因F 173L (D 5F 173L ),S 390G (D5S 390G )及正常人D5基因(hD5WT)（對照）轉基因小鼠左心室縮短分數的變化

A:各實驗組小鼠四至六月齡間左室縮短分數比較。

B:同月齡內各實驗組小鼠左心室縮短分數比較。

2.6左心室重量分析：D 5F 173L 轉基因小鼠左室重量四至六月齡均明顯高于hD5WT轉基因小鼠及非轉基因小鼠，且隨月齡增加差異顯著性增加(*P<0.05 vs. D5WT, 陰性對照, n=6，t test)

圖10 多巴胺D5突變基因F173L(D5F173L),S390G(D5S390G)及正常人D5基因(hD5WT)（對照）轉基因小鼠左室重量的變化

A:四組小鼠同月齡內左室重量比較。

B:四組小鼠四至六月齡間左室重量比較。

該結果表明血壓升高過程中左室心肌細胞發生肥大，從而引起多巴胺D5突變基因F173L(D5F173L)轉基因小鼠左心室的重構。

3. 腎組織病理切片HE染色及免疫組化結果顯示：多巴胺D5突變基因F173L(D5F173L)轉基因小鼠腎小球球囊間隙較正常人D5基因(hD5WT)（對照）轉基因小鼠稍微變窄，腎小管上皮細胞內Na-K-ATP酶表達有所增加。

圖2.多巴胺D5突變基因DF173L及正常人D5基因(hD5WT)轉基因小鼠腎組織HE染色及Na-K-ATP酶免疫組化結果

A: 正常人hD5WT基因轉基因小鼠腎組織HE染色。

B: 多巴胺D5突變基因DF173L轉基因小鼠腎組織HE染色

C: 免疫組織化學檢測Na-K-ATP酶在轉正常人hD5WT基因小鼠腎組織中的表達

D: 免疫組織化學檢測Na-K-ATP酶在轉突變基因多巴胺D5F173L小鼠腎組織中的表達

D5F173L轉基因多巴胺小鼠模型。

背景品系為C57BL/6小鼠，屬于動物界、脊索動物門、脊椎動物亞門、哺乳綱、嚙齒目、鼠科、家鼠屬、家鼠種的動物，1921年立特(Little)用艾比·拉特洛坡(Abby Lathrop)的小鼠株，雌鼠57號與雄鼠52號交配而得C57BL，1937年從C57BL分離出C57BL/6亞系培育而成。

由美國喬治敦大學Pedro A. Jose博士惠贈的pcDNA-h-D5F173L表達載體人D5F173L質粒，轉化入大腸桿菌JM109，搖菌擴增后測序，測序結果經Blast分析，顯示得到的pcDNA-D5-F173L與Genebank 中序列對比得到目的突變位點正確。用顯微注射法將線性化的轉基因載體注射到C57BL小鼠的受精卵中，用C57BL小鼠作假孕受體，制備轉基因小鼠。轉基因小鼠用堿裂解法提取基因組DNA。PCR法鑒定轉基因首建鼠及其子代基因型。Western blot檢測轉基因小鼠腎組織中D5R的表達。（圖1,圖2）

圖1 F1代轉基因鼠的PCR檢測

P：陽性對照；H：空白對照；N：陰性對照； M：DL2000 圖中37 9 10 15 17 20

21 22 24 27 33 34 35為F1代陽性轉基因小鼠；

圖2 Western Blotting 鑒定D5 F173L轉基因小鼠D5受體蛋白在腎臟的表達

1:野生型對照小鼠，2:32號首建鼠的F1代小鼠，3:4號首建鼠的F1代小鼠，

4:16號首建鼠的F1代小鼠

原發性高血壓是指原因不明，以動脈收縮壓和（或）舒張壓增高為特征，常伴有心、腦、腎等器官病理性改變的全身性疾病。原發性高血壓占高血壓患者的95%以上，在我國的影響人口超過1億人。高血壓對心臟、腎臟、腦均有影響，還可以造成眼底動脈硬化導致失明等并發癥。

原發性高血壓發病機制尚未明確，一般認為是基因和環境相互作用的共同結果，流行病學調查表明, 原發性高血壓有明顯的遺傳傾向。近20年來的研究發現，多巴胺通過抑制腎小管鈉的重吸收，對原發性高血壓的發生、發展起到重要的作用[1][2]，其可以通過自分泌/旁分泌的方式分泌到腎小管管腔、調節RPT段和髓袢升支粗段中的鈉轉運，可在腎單位的多個節段上抑制Na+的轉運，還可以通過抑制Na+-K+-ATPase活性實現利尿作用。多巴胺是通過多巴胺受體影響鈉的重吸收從而發揮其功能，近期的研究發現D5受體基因位點（chromosome4p15.1-16.1）與原發性高血壓有相關性，人D5受體基因多態性相關功能異常，包括 L88F、F173L、A269V、P330Q、C335X、N351D、S390G和S453G，研究發現轉染D5突變基因F173L后， CHO細胞刺激腺苷酸環化酶的活性降低, O2-產量顯著增加，因此,我們構建了D5F173L全身表達及心臟特異性表達的轉基因小鼠 ,從而進一步研究多巴胺D5受體在高血壓及心肌病發生發展過程中的重要作用。結果發現，D5F173L全身表達轉基因小鼠。