AAV注射誘導恒河猴亨廷頓病模型

給予動物鼠籠傾斜、潮濕墊料、高溫、噪音、束縛、電擊、游泳、晝夜節律顛倒等不同刺激因子，且刺激因子安排為多變性和不可預測，可誘導性是模型制造成功的關鍵。該模型被廣泛用于抑郁癥神經生物學機制及抗抑郁藥物的研究，以及伴發的焦慮、學習記憶障礙及防護藥物研究。

本研究中，通過水迷宮實驗、避暗實驗結果可以看CUMS模型組水迷宮尋臺潛伏期顯著性延長，避暗錯誤次數顯著性增加、避暗潛伏期顯著性減少等，這些行為學結果，提示大小鼠CUMS模型成功。此外本實驗還對CUMS模型的機制進行了基礎研究，認為CUMS模型會導致動物皮層的5-HT、DA、Ach、NE等神經遞質水平顯著性降低（P<0.05）。因此我們認為采用慢性不可預測應激，35天可以造成大鼠和小鼠學習記憶障礙。

模型技術難點在于對于CUMS刺激因子的選擇，刺激因子的選擇可能影響實驗模型的成功與否，常用的刺激因子有禁食(12 h)、禁水(12 h)、冷水游泳(4 °C，5 min)、熱水游泳(42 °C，5 min)、動物叫聲(0.5 h)、束縛(使用自行研發的小鼠行為限制器，長20 cm，直徑7 cm)、晝夜顛倒、配對飼養、濕籠、傾籠等。每日選擇2~3 種刺激，并盡量使應激程序符合不可預測的特點，以避免動物產生適應性。相同的刺激因子應該隔3-7日再進行。

本研究通過不同的刺激因子對老鼠造成慢性不可預測應激模型，通過水迷宮、避暗等經典行為學指標，以及5-HT、DA、Ach、NE等神經遞質基礎機制指標，表明了慢性不可預測應激誘導老鼠學習記憶損傷模型的成功，并且該模型對于大小鼠具有相同的效果，本模型可用于進一步的改善學習記憶藥物的藥效學評價。

本實驗采用健康成年SPF級老鼠。飼料墊料均為高壓滅菌產品，購自北京維通利華實驗動物有限公司，動物用水均經過除菌處理。實驗動物以完整的包裝直接進入實驗室，觀察適應5天后無異常情況，方進行實驗。實驗過程中動物操作均符合動物倫理學規范，對環境和生態影響等符合國家相關法律規定。

1、注射AAV-Exon1-103Q-GFP的恒河猴腦部病理表型

亨廷頓蛋白免疫熒光染色：

為了觀察注射入紋狀體的HD患者腦提取物在動物腦內的分布情況以及對神經細胞的影響，在立體定位注射手術后30周，注射部位免疫熒光染色的結果如圖1 A-H所示，（A-D）注射AAV-Exon1-103Q-GFP的模型組動物，在MAP2陽性細胞的胞質中有GFP和mHTT陽性聚集物的染色。（E-H）注射AAV-Exon1-19Q-GFP的對照組動物細胞質中出現彌漫性的GFP和mHTT陽性染色。（I）模型組和對照組紋狀體神經元數量未觀察到明顯改變。（J）模型組紋狀體星形膠質細胞數量增加。（K）與對照組相比，模型組細胞內外的mHTT聚集物數量更多。（L）對照組和模型組動物內源性HTT蛋白水平無明顯差異。

立體定位注射手術后30周，免疫熒光染色檢測注射部位mHTT的分布情況（A-H）。注射部位神經細胞密度和mHTT的分布水平（I-L）。

2、注射AAV-Exon1-103Q-GFP的恒河猴行為學表現

Viewpoint視頻監測系統檢測動物運動量

在腦立體定位注射HD患者腦提取物手術后，通過Viewpoint視頻系統對動物進行運動量檢測，結果如圖2所示，與對照組動物相比，（A）注射AAV-Exon1-103Q-GFP動物的總運動距離無明顯差異，（B）動作劇烈程度的分布無顯著差異，靜止、中等強度和劇烈活動的比例無明顯差異。對照組和模型組動物的活動量無明顯差異。

取物試驗（Object retrieval task）

在腦立體定位注射AAV-Exon1-103Q-GFP手術后，通過取物試驗檢測模型組和對照組動物的運動和認知功能水平。結果如圖3所示，與對照組相比，（A）注射AAV-Exon1-103Q-GFP后，模型組動物在取物訓練過程中出現的運動錯誤數量無明顯差異，（B）模型組動物取物訓練過程中出現的認知錯誤無明顯差異，（C）各組動物一次嘗試即正確完成的成功率無明顯差異。結果反映，模型組與對照組在上肢運動和認知功能上無明顯差異。

構建腺相關病毒（AAV2/6），表達具有103個CAG重復序列的mHTT，并帶有綠色熒光標記。將過表達變異亨廷頓蛋白的腺相關病毒通過腦立體定位注射的方法注射到恒河猴（5-6周歲，體重5-7公斤）雙側紋狀體內，從而建立亨廷頓病的恒河猴模型。每只動物注射AAV劑量為200μl，2.65×1013IU。

一、疾病名稱

亨廷頓病（Huntington’s disease，HD）

二、HD簡介

臨床癥狀主要表現為舞蹈樣不自主動作、精神障礙和進行性癡呆，稱為“三聯征”。

病理表現主要為基底節區萎縮，其中以尾狀核最為明顯，殼核和蒼白球也有不同程度的萎縮。神經元缺失主要見于基底節區和皮質。

發病機制是一種常染色體顯性遺傳性神經退行性疾病。患者第四號染色體上的Huntington基因發生變異，產生了變異的mHTT，在細胞內逐漸聚集，形成大的分子團，在腦中積聚，影響神經細胞的功能。

三、亨廷頓蛋白與HD

huntington基因處在第4號染色體的上部，亨廷頓病是由于huntington基因第1外顯子內部不穩定的CAG三核苷酸重復序列異常擴展而發病，屬于三聯體重復序列疾病。等位基因CAG的重復數在正常人多在26次以下，HD患者則多超過40.5次，平均46.42次，可高達100次。

huntington蛋白在全身各個器官包括中樞神經系統廣泛表達，其正常功能尚未完全明確，可能與神經系統發育、細胞內吞和分泌及抑制細胞凋亡有關。亨廷頓病患者huntington基因的重復CAG序列可產生一段多聚谷氨酰胺鏈（polyglutamine，polyQ），連于HTT的末端，使HTT與其他蛋白結合形成不溶性復合物（核內包涵體形成），并與其他蛋白相互作用，使神經元內蛋白錯誤折疊，影響蛋白的進展和降解過程，產生毒性功能。