非酒精性脂肪性肝病斑馬魚模型

該模型通過長期觀察普通狼瘡小鼠模型，待其到40周齡時，檢測其dsDNA等，結合皮膚癥狀變化，來確定慢性狼瘡皮膚病模型的建立。目前國際上尚欠缺類似模型，為研究狼瘡皮膚病發病機制提供了工具。

模型動物飼養在武漢大學人民醫院動物房SPF級動物實驗室，實驗動物使用許可證SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特點

門采用專用凈化密閉門并配備觀察窗。單向走道呈順時針走向設計。屏障系統內共有大鼠飼養室1間，小鼠飼養室3間，隔離觀察室1間，實驗準備室1間，潔物存放室1間，清洗消毒室1間。此外，屏障系統外配有監控室、機房和配電室等。

（2）設計參數

室內溫度：20～26°C；日溫差：≤4°C；相對濕度：40%～70%；換氣次數：15～20次/h；氣流速度：≤0．2m/s；壓強梯度：20～50Pa；空氣潔凈度：7級；菌落數：≤3個/皿；氨濃度：≤14mg/m3；噪聲：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；動物照度：15～20lx；晝夜明暗交替時間：12/12h。

（3）通風和空調系統

動物實驗室采用全新風中央空調通風系統。空氣經過初、中、三級過濾器后進入實驗室內環境。

（4）照明系統

一更、淋浴、二更、氣閘、清潔走道、潔物存放處、污物走道、緩沖間和清洗消毒間、動物飼養室、實驗準備間、隔離觀察室和功能實驗室等安裝有手動和自動開關，根據實際需要，調節控制室內照明燈。未啟用房間、清潔走道、潔物存放處、污物走道等在每日中午12點和晚上8點開啟紫外線燈照射1h。

（5）通訊系統

因為SPF級動物實驗室的環境和設施具有特殊要求，人員進入后不能隨意出入，而室內外的聯系又十分重要，故室內各房間均安裝內部電話機，按照房間順序編排電話號碼，各室內電話可相互連通，并均與監控室總機保持聯系，保證實驗室內外信息的及時溝通。

（6）監控系統

對SPF級動物實驗室的出入口、走道、實驗動物飼養室、功能操作室等重要位置均安裝了可作270°旋轉的攝像機，能夠及時了解設施的運行狀態；也能有效督促實驗人員執行科學的操作規程，避免人為因素造成室內環境和設施的污染；并對整個實驗期間的動物狀態和反應進行觀察，減少對動物的滋擾。

（7）供水系統

SPF級實驗動物飲用水以純凈水為宜。本實驗室采用管道供水，將處理后的純凈水用塑膠管道輸送到屏障系統內實驗準備室，設置接水槽，為實驗動物供應滅菌的飲用水和屏障系統內用水。要經常更換和清洗輸水管道，清洗籠具的用水添加適當比例的84消毒液。

（8）供電系統、警報系統和消防設施

SPF級動物實驗室要求全天候不間斷供風和供電，如果出現故障，不能及時發現和處理，就可能導致環境設施的污染、動物感染或死亡，造成嚴重后果。因此應對SPF級動物實驗室使用獨立穩定的供電系統，并配備有應急電源。在中央空調機房控制室安裝風機故障警報系統，以便及時檢修和維護，保證設施的安全運行。

（9）消毒滅菌設備

為防止外界物品進入SPF級動物實驗室時所攜帶的細菌污染室內環境和造成動物交叉感染，按照不同物品的特性，進行紫外線照射消毒、渡槽消毒液消毒或專用的機動門真空滅菌器消毒。

（10）動物飼養籠具

飼養大、小鼠的籠具聚碳酸脂材料的塑膠籠具，具有高透明、耐高壓、耐高溫、耐酸堿等特點。通用的不銹鋼籠具長、寬、高分別為40、30、20cm，適用于單籠飼養有特殊要求的實驗動物，配有底盤和食槽，確保實驗動物有充足的采食和活動空間，同時也保證室內環境的清潔。

（11）墊料的選擇和使用

在使用塑膠墊料時，墊料是大小鼠直接接觸的鋪墊物，起到吸濕、保暖和造窩的作用。墊料的好壞直接影響到大小鼠術后的恢復、生長發育和繁殖性能。目前，所使用的墊料主要有玉米秸墊料、刨花墊料。

（12）飼料配制

大小鼠的生產型飼料和維持型飼料必須嚴格按照國家標準，進行科學配制生產。每半年檢測一次飼料的微生物指標和有效營養成分指標，保證飼料的質量。

1. 動物癥狀觀察高膽固醇、高糖、高脂飲食的三組幼體體長均比 WT 組幼體體長增長。但高膽固醇、高脂飲食導致斑馬魚體重增加、肝區擴大，高脂組的幼體腹部和頭部的透明度明顯降低。高糖組體重未見變化，但頭部和內臟區透明度也明顯下降(圖 1)。

圖1. 高膽固醇、高糖或高脂飲食對斑馬魚幼體生長的影響(A) 四組不同飼喂方案；(B) 四組飲食飼喂終點時的幼體表型；(C) 幼體在15 dpf 的平均體3長 (n = 20).；和平均體重(n = 10，每組從100條中隨機取10條幼體稱重）。a, 與對照組比較; b,與EF組比較; c, 與HF組比較; *P < 0.05, #P < 0.01; Bar = 1 mm.2. 病理改變體內總膽固醇和總脂升高，顯微鏡下可見肝臟有明顯脂質蓄積和脂肪泡，肝結構改變（圖 2）。生化指標檢測顯示：過量飲食組的總脂質/甘油三酯、膽固醇和葡萄糖均明顯高于對照組。膽固醇組的總脂質/膽固醇明顯高于對照組，甘油三酯略高，葡萄糖低于對照組。高糖組的總脂質、甘油三酯和葡萄糖均高于對照組，而膽固醇水平與對照相當（圖 2F-I）。

圖 2. 脂質在斑馬魚幼體體內的蓄積A. 油紅染色示不同飲食組的幼體肝區脂質水平；B. 示四組幼體肝區膽固醇的蓄積水平；C. 示四組幼體軀干血管的膽固醇水平； D. 肝臟冰凍切片和油紅 O 染色顯示脂質在肝區的蓄積和脂肪變性；E. 肝臟石蠟切片和 H.E 染色顯示肝小葉排列變化和肝細胞內脂肪泡情況；F. 油紅染色陽性區半定量統計比較；G. 膽固醇與每毫克蛋白之比；H. 甘油三酯與每毫克蛋白之比；I. 糖與每毫克蛋白之比。F-I 數據來自斑馬魚肝臟。*P < 0.05 vs. Control. Bar =100 μm。

1. 實驗動物

野生型斑馬魚 AB 品系。

2. 造模化合物及斑馬魚處理

采用高脂、高糖、高膽固醇三種飲食方案飼喂斑馬魚幼體。具體方案見圖1（Ref.1）。主要步驟：取野生型斑馬魚幼體(5 dpf)，隨機分為4組：正常飲食(30mg/d AP100)、高膽固醇(30 mg/d AP100 plus 4% (w/w) cholesterol)、高糖(30 mg/dAP100 plus 0.25%(w/v) fructose)、高脂(180 mg/d AP100)，按照gezi 飲食方案飼喂10天。飼喂終止后，空腹過夜，收集幼體進行后續實驗檢測。為了觀察膽固醇在體內的分布，在4組食物中添加BODIPY 標記的膽固醇(10μg/g cholesterylBODIPY 542/563-C11, Invitrogen)。

3. 模型分析指標

（1） 癥狀觀察2觀察和拍照斑馬魚表型；測量斑馬魚幼體體長和稱重，統計學處理并比較 4組數據。

（2） 病理檢測A. 對斑馬魚整體進行油紅染色，檢測體內脂質蓄積水平和分布；熒光顯微鏡下觀察 BODIPY 標記的膽固醇在體內的分布和強度。B. 肝臟冰凍切片和油紅 O 染色；C. 肝臟石蠟切片和 H.E 染色。

（3） 病理診斷 采用肝臟組織切片和 HE 染色檢測，以脂質/膽固醇在肝臟蓄積、或以大泡性為主的肝細胞脂肪變性為特征。

一、疾病名稱

非酒精性脂肪性肝?。∟on-Alcoholic Fatty Liver Disease, NAFLD）

二、臨床發病機制及癥狀

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)被認為是僅次于酒精和病毒性肝炎導致肝硬化的第三大病因。NAFLD 是指除外酒精和其他明確的肝損傷因素所致的，以彌漫性肝細胞大泡性脂肪為主要特征的臨床病理綜合征，包括單純性脂肪性肝病以及由其演變的脂肪性肝炎和肝硬化。肥胖、II 型糖尿病、高脂血癥等單獨或共同成為 NAFLD 的誘因。NAFLD 多伴有中心性肥胖、胰島素抵抗和脂質代謝紊亂，也被認為是代謝綜合征的一種表現。病理特征：以大泡性或以大泡性為主的肝細胞脂肪變性為特征。

三、模式動物

斑馬魚(Zebrafish, Danio rerio) AB 或 TU 野生型品系均可。