調(diào)節(jié)腸道干細(xì)胞分化基因小鼠譜系示蹤模型

GD小鼠是由8個(gè)近交系小鼠，通過3代協(xié)同重組雜交，再經(jīng)20代近交傳代，獲得的重組近交系。相比8個(gè)原始親本，GD小鼠擁有豐富的遺傳型和表型，可用于多基因連鎖分析和新的疾病模型鑒定。

本模型不涉及除遺傳物質(zhì)重組對(duì)環(huán)境生態(tài)影響以外的其它安全性問題，本模型小鼠的保存、使用和處理均按照研究所倫理和安全委員會(huì)的要求執(zhí)行，可以確保不產(chǎn)生安全性問題。

1、 基因鑒定信息

圖1 Lgr5,Rosa26tdTomato基因凝膠電泳鑒定結(jié)果

2、組織化學(xué)染色結(jié)果

圖2 潘氏細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

圖3 杯狀細(xì)胞染色結(jié)果

3、譜系追蹤系統(tǒng)的建立

在顯微鏡下觀察誘導(dǎo)后不同時(shí)間點(diǎn)小腸干細(xì)胞的變化，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后3d隱窩底部已經(jīng)開始出現(xiàn)熒光，并有向上移動(dòng)的趨勢(shì)； 誘導(dǎo)后5d熒光細(xì)胞已經(jīng)移動(dòng)到隱窩的快速增殖細(xì)胞(TA)部； 誘導(dǎo)后7d可看到有少量從隱窩分裂分化的細(xì)胞已經(jīng)移動(dòng)到絨毛頂端；誘導(dǎo)后14d有更多的熒光細(xì)胞到達(dá)小腸絨毛頂端，少量絨毛從隱窩基底到絨毛頂尖則全部帶有熒光；誘導(dǎo)后45d可見整個(gè)小腸絨毛中熒光細(xì)胞更多、 更密實(shí)。 提示分化的細(xì)胞系來源于Lgr5 +干細(xì)胞， 小鼠小腸干細(xì)胞譜系追蹤模型成功建立。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：Lgr5-EGFP-CreERT2小鼠，ROSA26-tdTomato小鼠，Stat5 或 icS5 floxed小鼠

試劑：tamoxifen(100mg/kg)，4%PFA

儀器：冰凍切片機(jī)，leica DMI8活細(xì)胞項(xiàng)目合作單位

實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程：將Lgr5-CreGFP;RstdToamto-CreER 小鼠系與Stat5 或 icS5 floxed小鼠雜交，分別為對(duì)照組（Lgr5-CreGFP;RstdToamto-CreER）；實(shí)驗(yàn)1組（Lgr5-CreGFP；RstdToamto-CreER;Stat5）；實(shí)驗(yàn)2組（Lgr5-CreGFP；RstdToamto-CreER;icS5）。在小鼠4周齡時(shí)，提取雜交小鼠鼠尾DNA，通過凝膠電泳檢測(cè)小鼠基因型。Lgr5基因PCR引物序列如下(擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)174bp)。Common 8060：5'-CTGCTCTCTGCTCCCAGTCT-3'；Wild Type 8061：5'-ATACCCCATCCCTT TTGAGC-3'；Mutant 9402：5'-GAACTTCAGGGTCAGCTTGC-3'。PCR條件：預(yù)變性94℃3min；94℃變性30s，66℃復(fù)性1min，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。選取雙陽(yáng)性小鼠，6~8周齡，體重20~22g。實(shí)驗(yàn)組小鼠按100mg/kg體重腹腔注射他莫昔芬，對(duì)照組小鼠注射等量的玉米油。通過 Tam 誘導(dǎo)， 然后分別在 12?小時(shí)和 1, 3,5, 7, 30， 122和280天麻醉處死各組小鼠。分別取結(jié)腸、空腸、回腸組織，用冷PBS沖洗腸道組織，縱向剖開，放入多聚甲醛中固定過夜，制作冰凍切片在子代腸上皮細(xì)胞中追蹤檢測(cè)是否去除 Stat5 或活化 STAT5能夠改變腸上皮中的tdToamto 信號(hào)強(qiáng)度和位置.

譜系示蹤技術(shù)是一種利用Cre-loxP 位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)對(duì)干細(xì)胞細(xì)胞子代分化命運(yùn)進(jìn)行追蹤展示的方法，用于揭示特定類型干細(xì)胞在組織發(fā)育、疾病和再生中自我更新、分化和轉(zhuǎn)分化的現(xiàn)象。譜系示蹤系統(tǒng)可以追蹤來源于同一干細(xì)胞的所有子代細(xì)胞，是在成體哺乳類組織中研究干細(xì)胞特性的一種重要工具，通常使用Cre-LoxP系統(tǒng)，需要兩種品系小鼠：一種是具有組織或細(xì)胞特異性的Cre重組酶小鼠，另一種是帶有l(wèi)oxP-STOP-loxP（錨定STOP）序列的報(bào)告基因小鼠。通過他莫西芬誘導(dǎo)可在兩種品系雜交后的雙陽(yáng)性子代小鼠特定細(xì)胞內(nèi)表達(dá)Cre重組酶，以此剪切STOP序列，從而使報(bào)告基因得以表達(dá)，獲得遺傳基因改變的細(xì)胞，進(jìn)而達(dá)到示蹤的目的. 具體來講：在含有CreER的轉(zhuǎn)基因小鼠中，CreER由于在特定的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下，表達(dá)在特定的細(xì)胞類群中，當(dāng)CreER 小鼠與Rosa26（Rs）ER位點(diǎn)含有l(wèi)oxP 的報(bào)告基因（floxed基因）小鼠交配時(shí)，CreER 通過識(shí)別loxP 位點(diǎn)之間的終止序列切除，從而使含有RsCreER 的細(xì)胞類群表達(dá)出報(bào)告基因。由于這種切除使DNA水平上的，所以是永久不可逆的，因此，利用該細(xì)胞示蹤蹤技術(shù)可以解析特定細(xì)胞的起源和命運(yùn)。 研究背景 細(xì)胞因子激活酪氨酸蛋白激酶（JAK） /信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子（STAT） 5 是幾乎所有腸道細(xì)胞因子，生長(zhǎng)因子和生長(zhǎng)激素下游轉(zhuǎn)錄活化因子 。去除或減少 STAT5 能夠?qū)е屡咛ジ杉?xì)胞，造血干細(xì)胞，肝干細(xì)胞，髓樣干細(xì)胞，以及乳腺干細(xì)胞分化異常和組織功能障礙 。 我們實(shí)驗(yàn)室報(bào)道了敲除腸上皮 STAT5 導(dǎo)致 Lgr5+ IESC 再生障礙，上皮屏障缺失，增加腸炎易感性 。相反， 短暫的 STAT5 酪氨酸磷酸化（pYSTAT5） 能夠增加Lgr5+腸干細(xì)胞再生，保護(hù)腸道，減輕實(shí)驗(yàn)性腸炎。 但是， STAT5 是否能夠調(diào)節(jié) IESC 內(nèi)源性的轉(zhuǎn)錄、激活因子，調(diào)節(jié)何種上游細(xì)胞因子以及誘導(dǎo)何種腸上皮分化，還未見報(bào)道。因此我們使用特定的 Stat5 復(fù)合基因工程小鼠與Lgr5CreER-GFP-RstdToamtoCreER 小鼠，進(jìn)行腸上皮細(xì)胞分化的譜系追蹤來確定持續(xù)性的 pYSTAT5 激活能夠誘導(dǎo)腸道干細(xì)胞分化為何種細(xì)胞類型。