治療后結核潛伏及再發的短程小鼠模型

該模型的主要評價指標為不同感染期的肺脾肝荷菌量和病變評分值，該模型與國內外報道的經典cornell模型類似，但是cronell模型的問題在于模型潛伏期荷菌量過高，復發期3-9個月后不等。本模型不斷的摸索嘗試克服以上問題，模型均一，參數指標穩定，各感染期的荷菌量值水平合適（不過低也不過高），周期明顯縮短，由3-9個月不等的周期縮短到比較穩定的10周，便于應用。

該模型不僅可以用于潛伏及復發的早期診斷分子的研究，還可以利用潛伏及復發期研究疾病機制，同時可以用于評價潛伏感染的預防性抗生素效果，以及治療性疫苗的效果。

動物模型的制備的設計得到研究所IACUC委員會的批準，人員都是訓練有素的研究人員和實驗人員，全程在ABSL-3實驗室中進行，完全按照模型制備和檢測的一系列SOP操作進行，遵守生物安全操作要求，無安全事故。

1. 荷菌量檢測結果

結核活動性感染的第二周，采用異煙肼治療4周，4周后進入潛伏期，肺脾肝荷菌量為0，治療后自然復發及誘導復發后肺脾肝荷菌量明顯升高，其中誘導后復發水平更高，以活動期的同期肺荷菌量為對照（control）。在感染不同階段檢測肺脾肝組織的荷菌量值與個感染期的菌復制標準吻合。其中肺組織荷菌量為判斷的主要標準，結果如下：

圖2 潛伏期和再發期肺組織的荷菌量

左圖：肺組織的潛伏期荷菌量的對數，右圖是復發期各組的肺組織荷菌量。**P<0.01,***P<0.001

2. 病理病變結果

結核活動性感染的第二周，采用異煙肼治療4周，4周后進入潛伏期，肺脾肝病理病變明顯減輕，治療后自然復發及誘導復發后肺脾肝病變加重，其中誘導后復發水平更明顯，以活動期的同期肺病變為對照（control）。在感染不同階段檢測肺脾肝組織病變評分與個感染期的菌復制標準吻合。其中肺組織病變為判斷的主要標準，結果如下：

圖3 潛伏期和再發期肺組織的病變評分

左圖：肺組織的潛伏期肺病變評分，右圖是復發期各組的肺病變評分。**P<0.01,***P<0.001

3. 模型的評價

本模型采用的評價主要采取以整體表觀效度的評價方法，核心指標是每個感染期的組織病變和荷菌量，根據結核病的不同感染期標準的參數來評估。比如小鼠感染后前兩周，表現為活動性結核模型，肺脾肝組織有明顯的病變，荷菌量達到104CFU以上，用抗結核藥物治療一個月后，與臨床上治療對應，小鼠中活動性結核菌被殺滅，剩余的菌潛伏在肺脾肝組織中，表現為組織荷菌量呈極低水平，有些小鼠的荷菌量可為0值，與此同時，肺脾肝組織的病變減輕，表現為輕微炎癥或無明顯病變，綜合組織荷菌量和病變指標，可以判斷此階段較好的模擬臨床上潛伏感染狀態。值得注意的是，該階段與治愈的區別在于，潛伏后小鼠可以自然或通過誘導劑引起肺脾肝組織中結核菌復燃，結核再活動，表現為荷菌量反彈升高，呈現明顯的病變。

4.模型的驗證

通過設置無治療的感染對照組，以及無誘導劑的對照組，可以判斷，治療后小鼠處于潛伏期，誘導后潛伏的結核菌可導致結核的再發。

另外的實驗，通過設置不同的治療方案，比如單用抗結核化療藥異煙肼，以及異煙肼搭配免疫制劑PD-L1抗體，與對照組比較，綜合判斷復發期的起始時間點、荷菌量水平、病變程度，來確定治療效果。

本模型已至少通過3個批次的實驗來重復驗證，參數指標穩定。

（一）實驗材料

1. 試劑

1）LEAFTM Purified Anti-Mouse TNF-α(Biolegend，美國)

2）Isoniazid(Sigma，美國)

3）蘇木精-伊紅染料（HE染料）

5）0.01M PBS等

6）FBS（Life TechnologiesCorporation，USA）

8）4%多聚甲醛

9）75%醫用消毒酒精（北京貞玉民生藥業有限公司）

10）分支桿菌藥敏羅氏培養管中性羅氏培養管（珠海貝索生物技術有限公司，中國）

11）Trizol（Invitrogen）

12）二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）

13）一次性無菌培養皿（康寧 ）

14）眼科剪（經高壓滅菌）15）眼科鑷（經高壓滅菌）16）EP管（1.5mL）（Axygen）

17）胰島素注射器（BD,美國）

18）1mL注射器（雙鴿，中國）

19）組織研磨器（美天旎，德國）

2. 儀器設備

1）數顯鼓風干燥箱(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)

2）NanoZoomerS60明場熒光切片掃描儀（日本）

3）溫控水浴鍋(北京市六一儀器廠)

4）超低溫冰箱(三洋，日本)

5）低溫高速離心機(BECKMAN，美國)

6）臺式離心機(上海安亭離心機廠)

7）可調微量1ml, 200ul, 100 ul, 20ul, 10 ul移液器(Gilson公司)

8）Ⅱ級生物安全柜（哈爾濱東聯哈爾）

9）渦旋振蕩器（QILINBEIER,QL-861）

10）960 Bacteria MGIT系統（BD，美國）

11）細菌超聲分散計數儀（廣東體必康生物科技有限公司，中國）

12）高速低溫離心機（Thermo Scientific）

13) 組織研磨器（美天旎，德國）

14）電子天平（Ohaus Corp·PineBrook，USA）

15）組織脫水機（Leica）

16）石蠟包埋機（Leica）

17）石蠟切片機

18）電磁爐

（二) 實驗設計

（三）動物感染和取材 固定小鼠于小鼠固定器中，暴露小鼠鼠尾，用75%酒精棉球擦拭鼠尾以暴露尾靜脈， 以1.0×107CFU/mL的 H37Rv 200uL/只尾靜脈感染C57BL/6小鼠，兩周之后給予異煙肼（10mg/kg）連續治療四周，之后TNF-α抗體（50ug/只/周）誘導四周。每個時間點各組分別取4只小鼠脫頸椎處死，解剖取脾臟、肺臟、肝臟組織進行荷菌量的檢測和病理分析，所有的實驗均在生物安全3級實驗室（ABSL-3）進行操作。

（四）組織荷菌量檢測 （1）生物安全柜中，用眼科鑷取左側肺組織、脾頭1/3及肝靠腹背部的小葉部分用于組織研磨。 （2）組織依次用生理鹽水、4%硫酸和生理鹽水漂洗，加1mL生理鹽水到研磨器中研磨，各組織研磨的勻漿液分別取100μL，用生理鹽水按照1：10的比例進行梯度稀釋5個濃度梯度，分別是10-1，10-2，10-3，10-4，10-5。 （3）取合適的三個稀釋度的組織稀釋液50或100μL，接種在分支桿菌中性羅氏培養管中，使組織研磨液能夠充分的被固體培養基吸收，每個梯度各接種3管。 （4）將接種好的組織培養基的羅氏固體培養基置于斜面上，之后置于37℃，5%CO2的培養箱中，培養4周進行菌落計數。 （五） 組織病理分析 余下的脾、肺、肝組織置于4%中性甲醛固定液中固定一周后，脾臟和肝臟組織分別按長軸最大橫切面進行修塊，肺組織完整分離小肺葉。 按照常規石蠟切片制作方法包埋、修塊、制片，HE染色后分析組織病理病變，HE片用NanoZoomer S60明場熒光切片掃描儀進行明場半自動掃片，掃完的HE片子用專用固態硬盤拷出，用VDP.View 2軟件對病變組織進行定量分析。 病理診斷和分析由至少兩名病理資深診斷專家采取雙盲方法讀片和給出報告。分析單位面積（mm2)的肺組織中肉芽腫面積，單位面積（mm2)脾臟內白髓內肉芽腫的面積，單位面積（mm2)肝臟內肉芽腫個數。 （六）數據分析 所有數據均采用均數±標準差(`x±s ) 表示。采用統計軟件Graphpad prism 7進行統計分析。結果采用單因素方差分析( One-way ANOVA)，t檢驗和Tukey 檢驗分析組間差異是否顯著，P <0.05認為差異有顯著性。

一、疾病概述

結核病是由結核分支桿菌感染后所致的疾病，結核分支桿菌感染后約90%以上的人群不發病，呈隱性感染，即潛伏感染，約10%的人群感染后形成活動性結核病，多見肺結核，少量人群出現結核性胸膜炎、結核性腦膜炎、腸結核、骨結核、淋巴結核和眼結核等。

肺結核的臨床表現較為明顯，有咳嗽咳痰，午后低熱盜汗，嚴重者有咯血等表現，通過結核菌素的皮試陽性，痰菌培養陽性以及胸片學變化可以診斷肺結核。對于一部分痰培養陰性的結核患者，綜合臨床變現、皮試、胸片結果及其他血液學和免疫學指標輔助診斷，特殊情況下可以進行治療性診斷。

Dannenberg等將結核菌感染和發病的生物學過程可分為起始期、T細胞反應期、共生期和細胞外繁殖傳播期。侵入呼吸道的結核菌被肺泡巨噬細胞吞噬。細菌在肺泡巨噬細胞內存活和復制，便擴散至鄰近非活化的肺泡巨噬細胞和形成早期感染灶。否則若被殺滅，則不留任何局部證據。在T細胞反應期，結核菌在巨噬細胞內的最初生長，形成中心呈固態干酪壞死的結核灶，它能限制結核菌繼續復制。由T細胞介導的細胞免疫（cell?mediatedimmunity，CMI）和遲發性變態反應（delaytype hyperensitivity，DTH）在此形成，從而對結核病發病、演變及轉歸產生決定性影響。大多數感染者發展至T細胞反應期，僅少數發生原發性結核病。大部分感染者結核菌可以持續存活，細菌與宿主處于共生狀態。纖維包裹的壞死灶干酪性中央部位被認為是持續存在的主要場所。低氧、低pH和抑制性脂肪酸的存在使細菌不能增殖。宿主的免疫機制亦是抑制細菌增殖的重要因素，免疫損害便可引起受抑制結核菌的重新活動和增殖，大量結核菌從液化干酪灶釋放形成播散。

活動性結核通過標準的短程化療可以治愈，然而由于治療期較長，有些病人并不能很好的堅持全程化療，在治療一個月后，結核的癥狀基本消失，但是機體中依然潛伏有少量結核菌，機體免疫正常時，可以在較長時間內都不出現癥狀發病，當機體抵抗力下降時，潛伏在體內的結核菌大量復制增殖，表現為結核病的再活動。

二、模型背景

1、結核菌菌株信息

本模型所用的病原菌為結核菌標準株H37Rv，是國際公認的模型用菌株，該菌株為單細胞克隆，基因序列已知，對抗結核藥物敏感。

2、實驗動物背景信息

本模型所用的實驗動物為C57BL/6小鼠，SPF級，4-6周齡的雌性小鼠。C57小鼠對結核菌比較敏感，并且該品系小鼠是很多基因工程小鼠的背景小鼠，便于進行結核病的機制研究。此外，小鼠作為實驗動物，相應的免疫試劑比較齊全，而且動物成本相對較低，飼養的空間要求較其它實驗動物低，易于開展實驗。

3、研究背景

該動物模型的研究目的及意義；該動物模型的國內外研究進展并附參考文獻。

治療后潛伏感染及再發的模型，主要模擬臨床上活動性結核病人治療后，癥狀消失，但是未徹底清除體內潛伏結核菌，當機體免疫力降低時，潛伏的結核菌復燃，結核病再活動的病人。該模型，不僅可用于潛伏感染的疫苗評價，潛伏期預防性治療的藥物和方案評價，還可以通過比較不同感染期，研究潛伏感染的早期診斷分子，疾病再發的機制。

目前，國內外報道的治療后潛伏及再發的小鼠模型，即Cornell模型，該模型周期較長，潛伏期的組織菌量較高，可達到103以上的數量級，不能很好的模擬人群中潛伏的狀態，此外，潛伏期后再發的時間和水平存在組內個體差異大的問題，因此，已有的模型需要優化，以便更能模擬潛伏和再發的狀態，同時盡量使模型的組內均一性提高，縮短模型的周期，便于實際應用。

參考文獻

[1] 呂艷,劉文文,王聰,趙微,王濤,白麗.結核分支桿菌H37Ra感染小鼠模型建立及其對B細胞發育分化特征的實驗研究[J].中國預防醫學雜志,2019,20(01):58-62.

[2] deSteenwinkel JE, de Knegt GJ, ten Kate MT, et al. Relapse of tuberculosis versusprimary tuberculosis; course, pathogenesis and therapy in mice[J]. Tuberculosis(Edinb), 2013, 93(2): 213-21.

[3] Ma J, TengX, Wang X, et al. A Multistage Subunit Vaccine Effectively Protects MiceAgainst Primary Progressive Tuberculosis, Latency and Reactivation[J].EBioMedicine, 2017, 22: 143-154.

[4]占玲俊,盧錦標,唐軍,陳保文,秦川.耐藥結核分支桿菌潛伏-復發感染動物模型的研究進展[J].微生物與感染,2016,11(01):59-64.

[5]師長宏.結核桿菌潛伏感染小鼠模型的制備及其評價指標[J].中國實驗動物學報,2010,18(06):538-541.

[6]林樹柱,董娜,向志光,徐艷峰,占玲俊,馬春梅,秦川.結核分支桿菌低劑量感染小鼠模型的建立與分析[J].中國防癆雜志,2012,34(12):817-820。