Armh4基因敲除心肌肥厚小鼠模型

Armh4基因敲除小鼠模型，采用的是基于CRISPR/Cas9技術的完全性基因敲除（Conventional Knockout,KO）。完全性基因敲除是把敲除目的基因的所有外顯子或幾個總要的外顯子功能區敲除掉，獲得全身所有的組織和細胞中都不表達該基因的小鼠模型。Armh4基因敲除小鼠模型為完全性基因敲除模型（KO），該模型應用范圍廣，可以制造針對各類疾病不同組織器官細胞的疾病模型。

CRISPR/Cas9技術的優點在于其對基因進行定位的精準編輯，在向導RNA（guide RNA，gRNA）和Cas9蛋白的共同作用下，細胞基因組DNA（被看成外源DNA）將被準確剪切。但是，被CRISPR/Cas9剪切需要滿足幾個條件。第一，待編輯的區域附近需要存在相對保守的PAM序列（NGG）。第二，向導RNA要與PAM上游的序列堿基互補配對。

模型動物飼養在武漢大學人民醫院動物房SPF級動物實驗室，實驗動物使用許可證SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特點

門采用專用凈化密閉門并配備觀察窗。單向走道呈順時針走向設計。屏障系統內共有大鼠飼養室1間，小鼠飼養室3間，隔離觀察室1間，實驗準備室1間，潔物存放室1間，清洗消毒室1間。此外，屏障系統外配有監控室、機房和配電室等。

（2）設計參數

室內溫度：20～26°C；日溫差：≤4°C；相對濕度：40%～70%；換氣次數：15～20次/h；氣流速度：≤0．2m/s；壓強梯度：20～50Pa；空氣潔凈度：7級；菌落數：≤3個/皿；氨濃度：≤14mg/m3；噪聲：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；動物照度：15～20lx；晝夜明暗交替時間：12/12h。

（3）通風和空調系統

動物實驗室采用全新風中央空調通風系統。空氣經過初、中、三級過濾器后進入實驗室內環境。

（4）照明系統

一更、淋浴、二更、氣閘、清潔走道、潔物存放處、污物走道、緩沖間和清洗消毒間、動物飼養室、實驗準備間、隔離觀察室和功能實驗室等安裝有手動和自動開關，根據實際需要，調節控制室內照明燈。未啟用房間、清潔走道、潔物存放處、污物走道等在每日中午12點和晚上8點開啟紫外線燈照射1h。

（5）通訊系統

因為SPF級動物實驗室的環境和設施具有特殊要求，人員進入后不能隨意出入，而室內外的聯系又十分重要，故室內各房間均安裝內部電話機，按照房間順序編排電話號碼，各室內電話可相互連通，并均與監控室總機保持聯系，保證實驗室內外信息的及時溝通。

（6）監控系統

對SPF級動物實驗室的出入口、走道、實驗動物飼養室、功能操作室等重要位置均安裝了可作270°旋轉的攝像機，能夠及時了解設施的運行狀態；也能有效督促實驗人員執行科學的操作規程，避免人為因素造成室內環境和設施的污染；并對整個實驗期間的動物狀態和反應進行觀察，減少對動物的滋擾。

（7）供水系統

SPF級實驗動物飲用水以純凈水為宜。本實驗室采用管道供水，將處理后的純凈水用塑膠管道輸送到屏障系統內實驗準備室，設置接水槽，為實驗動物供應滅菌的飲用水和屏障系統內用水。要經常更換和清洗輸水管道，清洗籠具的用水添加適當比例的84消毒液。

（8）供電系統、警報系統和消防設施

SPF級動物實驗室要求全天候不間斷供風和供電，如果出現故障，不能及時發現和處理，就可能導致環境設施的污染、動物感染或死亡，造成嚴重后果。因此應對SPF級動物實驗室使用獨立穩定的供電系統，并配備有應急電源。在中央空調機房控制室安裝風機故障警報系統，以便及時檢修和維護，保證設施的安全運行。

（9）消毒滅菌設備

為防止外界物品進入SPF級動物實驗室時所攜帶的細菌污染室內環境和造成動物交叉感染，按照不同物品的特性，進行紫外線照射消毒、渡槽消毒液消毒或專用的機動門真空滅菌器消毒。

（10）動物飼養籠具

飼養大、小鼠的籠具聚碳酸脂材料的塑膠籠具，具有高透明、耐高壓、耐高溫、耐酸堿等特點。通用的不銹鋼籠具長、寬、高分別為40、30、20cm，適用于單籠飼養有特殊要求的實驗動物，配有底盤和食槽，確保實驗動物有充足的采食和活動空間，同時也保證室內環境的清潔。

（11）墊料的選擇和使用

在使用塑膠墊料時，墊料是大小鼠直接接觸的鋪墊物，起到吸濕、保暖和造窩的作用。墊料的好壞直接影響到大小鼠術后的恢復、生長發育和繁殖性能。目前，所使用的墊料主要有玉米秸墊料、刨花墊料。

（12）飼料配制

大小鼠的生產型飼料和維持型飼料必須嚴格按照國家標準，進行科學配制生產。每半年檢測一次飼料的微生物指標和有效營養成分指標，保證飼料的質量。

1. 鑒定PCR結果圖解 我們通過PCR都小鼠進行了鑒定，如圖1，目前已經得到純和子。

圖1：ArmH4 KO小鼠鑒定PCR結果圖。WT：407bp的條帶；HOMO：255bp的條帶；HET：407bp、255bp的條帶。2. Armh4在PE誘導的新生大鼠心肌細胞肥大水平的作用

通過PE誘導構建新生大鼠心肌細胞肥大模型。qRT-PCR結果顯示，過表達Armh4心肌肥厚標志物ANP、BNP表達量升高，表明過表達Armh4基因加重心肌肥厚（圖2）。而敲低Armh4后結果顯示，ANP、BNP表達量降低，表明敲低Armh4后減輕心肌肥厚（圖2）。

圖2.在新生大鼠心肌細胞中，分別過表達和敲除ArmH4基因對PE所誘導的心肌肥厚水平的影響。

野生型的八周齡年輕小鼠與22個月的衰老小鼠的心臟qRT-PCR結果表明，Armh4 mRNA水平顯著升高（圖3）。結合Armh4對心肌肥厚的影響，我們推測過表達Armh4會加速健康心臟衰老。

圖3.ArmH4在年輕小鼠和衰老小鼠中的mRNA表達水平。

1.項目設計: 利用CRISPR/Cas9技術進行ARMH4 基因敲除小鼠構建。在共同的exon2的附近設計以NGG結尾的靶點，在CRISPR/Cas9作用下進行切割。

2．guideRNA信息:

Armh4 -sgRNA1：ATGGGAACTACTGTCGTTCCTGG

Armh4 -sgRNA2：CAACAGCTGGCAGTATTTTGGGG

3.構建PE誘導的心肌肥大細胞模型，檢測ArmH4敲低后心肌肥厚分子標志物水平，分別提取總RNA，通過qRT-PCR檢測心肌肥厚指標ANP、BNP的mRNA水平。

4. 取野生型的八周齡年輕小鼠與22個月的衰老小鼠的心，通過qRT-PCR檢測Armh4 mRNA水平。

一、疾病概述 肥厚型心肌病 ( Hypertrophic cardiomyopathy) 是一種器質性心臟疾病，主要表現為左心室和(或)右心室及室間隔不對稱肥厚、心室腔變小、心室順應性降低。病因：肥厚型心肌病是常染色體顯性遺傳性疾病，60%～70%為家族性，30%～40%為散發性，家族性病例和散發病例、兒童病例和成年病例具有同樣的致病基因突變。 臨床表現： 1.以青壯年多見、常有家族史。 2.可以無癥狀，也可以有心悸、勞力性呼吸困難、心前區悶痛、易疲勞、暈厥甚至猝死，晚期出現左心衰的表現。 3.梗阻性肥厚型心肌患者胸骨左緣可出現粗糙的收縮中晚期噴射性雜音，可伴震顫，應用洋地黃制劑、硝酸甘油、靜點異丙腎上腺素及Valsalva動作后雜音增強，反之應用β受體阻滯劑、去甲腎上腺素、下蹲時雜音減弱。有些病人聞及S3及S4心音及心尖區相對性二尖瓣關閉不全的收縮期雜音。 臨床診斷：超聲心動圖提示左心室壁或（和）室間隔厚度≥15mm，排除了其他引起心肌肥厚的原因如高血壓病、風濕性心臟病二尖瓣病、先天性心臟?。ǚ块g隔、室間隔缺損）及代謝性疾病伴發心肌肥厚。 二、模型背景1、Armh4基因信息? 敲除基因名稱（NCBI號）：67419? 敲除基因NCBI網址鏈接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/67419? 敲除基因名稱（MGI號）：Armh4（MGI: 1914669）? 敲除基因Ensembl網址鏈接：http://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Transcript/Summary?db=core;g=ENSMUSG00000036242;r=14:49675952-49783383;t=ENSMUST00000036972? 方案針對的轉錄本（Ensembl號）：ENSMUST00000036972.13? 方案敲除的exon：exon 22、實驗動物背景信息 所采用的小鼠品系為C57BL/6。 來源：1921年立特(Little)用艾比·拉特洛坡(Abby Lathrop)的小鼠株，雌鼠57號與雄鼠52號交配而得C57BL1937年從C57BL分離出C57BL/6和C57BL/10兩個亞系。1985年從Olac引到中國醫學科學院實驗動物研究所。 毛色：黑色。

主要特性：①乳腺腫瘤自然發生率低，化學物質難以誘發乳腺和卵巢腫瘤。②12%有眼睛缺損;雌仔鼠16.8%，雄仔鼠3%為小眼或無眼。用可的松可誘發腭裂，其發生率達20%。③對放射物質耐受力中等;補體活性高;較易誘發免疫耐受性。④對結核桿菌敏感。對鼠痘病毒有一定抵抗力。⑤干擾素產量較高。⑥嗜酒精性高，腎上腺素類脂質濃度低。對百日咳組織胺易感因子敏感。⑦常被認作"標準"的近交系，為許多突變基因提供遺傳背景。

主要用途：是腫瘤學、生理學、免疫學、遺傳學研究中常用的品系。3、研究背景 該動物模型的研究目的及意義；該動物模型的國內外研究進展并附參考文獻。 肥厚型心肌病 ( Hypertuophic cardiomyopathy, HCM) 是一種器質性心臟疾病，主要表現為左心室和( 或) 右心室及室間隔不對稱肥厚、心室腔變小、心室順應性降低1。具有獨特的病理生理特征和多種形態、功能和臨床特征2。已有研究證明，HMC是常染色體顯性遺傳性疾病，60%～70%為家族性，30%～40%為散發性。雖然很多人認為肥厚性心機病是一種相對不常見的心臟疾病，但有研究表明，從以社區為基礎的普通人群中選擇的一大批明顯健康的年輕人中，超聲心動圖結果判定的HCM，發病率高達0.2% 2。HMC最常見發生于10到25歲之間的青年人，是年輕、健康的個人和運動員猝死的主要原因2。當然心肌肥厚不僅涉及肥厚性心肌病，也是心力衰竭過程中代償性機制的體現。 衰老，系指隨著時間的增加，生命體功能衰退的過程3。壽命長用做低等模式生物評價衰老最重要的指標；而在高等動物中，細胞、組織與器官結構與功能復雜，單純用壽命作為衰老的唯一指標并無全面，有研究認為，改善衰老相關疾病被認為是減輕衰老的表現4,5。衰老相關的系統性疾病包括：心腦血管疾病、腫瘤、骨關節炎、糖尿病與神經退行性疾??；相關研究也通常會記錄衰老相關疾病的狀態來評價個體衰老的情況6。在與年齡增長有關的疾病和失調中，最使人衰弱的疾病之一是喪失正常的心功能，從而導致心力衰竭7。左心室肥厚是心臟衰老的重要特征，可導致舒張功能不全和心力衰竭8。從逆轉心肌肥厚的角度，探究是否能夠減緩衰老的發生和發展。 β-連環蛋白（β-catenin）包含重復的~ 42個氨基酸序列,稱為犰狳(Armadillo)重復,折疊在一起形成一個單一的、剛性的犰狳域(Armadillo domain, ARM)。含有ARM的蛋白質通?？梢越Y合與細胞骨架構成相關的蛋白，如細胞接觸和細胞骨架相關蛋白，以及通過產生和轉導影響基因表達信號的傳導功能9。ARM蛋白是一個龐大而多樣的家族，包含犰狳重復或犰狳樣螺旋結構域。我們篩選出的Armh4(Armadillo-like helical domain containing 4)為暫未明確特征的編碼小鼠蛋白基因。與有文獻報道Armh4在成人造血系統惡性腫瘤,通過抑制mTORC2的激酶活性，進一步負向調控STAT3信號通路，從而發揮抑制造血系統惡性腫瘤的作用10。另有研究報道，Armh4與心臟的發生有關11，Armh4是FHF（first heart field）和SHF（second heart field）心肌細胞衍生物的特異性標記物?？傮w上，目前關于Armh4的研究較少。 本研究通過在NRVM上過表達、敲低Armh4發現，過表達Armh4加重心肌肥厚，敲低改善心肌肥厚，并且對比年輕小鼠與衰老小鼠Armh4的mRNA水平，發現在衰老小鼠中Armh4的mRNA水平是上升的。而目前尚未報道Armh4在心肌肥厚發生過程中的作用，因此本項目擬探究Armh4對心肌肥厚的影響及探究其潛在的分子機制，為進一步治療心肌肥厚相關疾病尋找治療靶點；同時也探究Armh4對衰老的影響，是否存在通過對Armh4干預，延緩衰老。參考文獻：1 Dadson, K., Hauck, L. & Billia, F. Molecular mechanisms in cardiomyopathy. Clin Sci (Lond) 131, 1375-1392, doi:10.1042/CS20160170 (2017).2 Maron, B. J. & Maron, M. S. Hypertrophic cardiomyopathy. The Lancet 381, 242-255, doi:10.1016/s0140-6736(12)60397-3 (2013).3 Lopez-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M. & Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell 153, 1194-1217, doi:10.1016/j.cell.2013.05.039 (2013).4 Kaeberlein, M., McVey, M. & Guarente, L. The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms %J Matt Kaeberlein;Mitch McVey;Leonard Guarente. 13 (1999).5 Rogina, B., Helfand, S. L. & Ames, B. N. Sir2 Mediates Longevity in the Fly through a Pathway Related to Calorie Restriction %J Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (2004).6 Childs, B. G. et al. Senescent cells: an emerging target for diseases of ageing. Nat Rev Drug Discov 16, 718-735, doi:10.1038/nrd.2017.116 (2017).7 Schocken, D. D. et al. Prevention of heart failure: a scientific statement from the American Heart Association Councils on Epidemiology and Prevention, Clinical Cardiology, Cardiovascular Nursing, and High Blood Pressure Research; Quality of Care and Outcomes Research Interdisciplinary Working Group; and Functional Genomics and Translational Biology Interdisciplinary Working Group. Circulation 117, 2544-2565, doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.107.188965 (2008).8 Lakatta, E. G. & Levy, D. Arterial and cardiac aging: major shareholders in cardiovascular disease enterprises: Part II: the aging heart in health: links to heart disease. Circulation 107, 346-354, doi:10.1161/01.cir.0000048893.62841.f7 (2003).9 Tewari, R., Bailes, E., Bunting, K. A. & Coates, J. C. Armadillo-repeat protein functions: questions for little creatures. Trends Cell Biol 20, 470-481, doi:10.1016/j.tcb.2010.05.003 (2010).10 Lee, D. et al. Endogenous transmembrane protein UT2 inhibits pSTAT3 and suppresses hematological malignancy. J Clin Invest 126, 1300-1310, doi:10.1172/JCI84620 (2016).11 Conway, S. J., McConnell, R., Simmons, O. & Snider, P. L. Armadillo-like helical domain containing-4 is dynamically expressed in both the first and second heart fields. Gene Expression Patterns 34, doi:10.1016/j.gep.2019.119077 (2019).