Igfbp5基因敲除肺結核小鼠模型

Igfbp5基因敲除小鼠模型，采用的是基于CRISPR/Cas9技術的完全性基因敲除（Conventional Knockout,KO）。完全性基因敲除是把敲除目的基因的所有外顯子或幾個總要的外顯子功能區敲除掉，獲得全身所有的組織和細胞中都不表達該基因的小鼠模型。Armh4基因敲除小鼠模型為完全性基因敲除模型（KO），該模型應用范圍廣，可以制造針對各類疾病不同組織器官細胞的疾病模型。

CRISPR/Cas9技術的優點在于其對基因進行定位的精準編輯，在向導RNA（guide RNA，gRNA）和Cas9蛋白的共同作用下，細胞基因組DNA（被看成外源DNA）將被準確剪切。但是，被CRISPR/Cas9剪切需要滿足幾個條件。第一，待編輯的區域附近需要存在相對保守的PAM序列（NGG）。第二，向導RNA要與PAM上游的序列堿基互補配對。

肺結核系一種發病率高、傳染性強的呼吸系統疾病，大量研究表明IGFBP5與肺組織的發育、肺纖維化和肺癌緊密相關，然而，目前暫無相關研究探討IGFBP5在肺結核中的作用。考慮到肺結核與肺癌的關系密切，因此探究IGFBP5在肺結核疾病中的潛在作用及分子機制至關重要。

模型動物飼養在武漢大學人民醫院動物房SPF級動物實驗室，實驗動物使用許可證SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特點

門采用專用凈化密閉門并配備觀察窗。單向走道呈順時針走向設計。屏障系統內共有大鼠飼養室1間，小鼠飼養室3間，隔離觀察室1間，實驗準備室1間，潔物存放室1間，清洗消毒室1間。此外，屏障系統外配有監控室、機房和配電室等。

（2）設計參數

室內溫度：20～26°C；日溫差：≤4°C；相對濕度：40%～70%；換氣次數：15～20次/h；氣流速度：≤0．2m/s；壓強梯度：20～50Pa；空氣潔凈度：7級；菌落數：≤3個/皿；氨濃度：≤14mg/m3；噪聲：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；動物照度：15～20lx；晝夜明暗交替時間：12/12h。

（3）通風和空調系統

動物實驗室采用全新風中央空調通風系統。空氣經過初、中、三級過濾器后進入實驗室內環境。

（4）照明系統

一更、淋浴、二更、氣閘、清潔走道、潔物存放處、污物走道、緩沖間和清洗消毒間、動物飼養室、實驗準備間、隔離觀察室和功能實驗室等安裝有手動和自動開關，根據實際需要，調節控制室內照明燈。未啟用房間、清潔走道、潔物存放處、污物走道等在每日中午12點和晚上8點開啟紫外線燈照射1h。

（5）通訊系統

因為SPF級動物實驗室的環境和設施具有特殊要求，人員進入后不能隨意出入，而室內外的聯系又十分重要，故室內各房間均安裝內部電話機，按照房間順序編排電話號碼，各室內電話可相互連通，并均與監控室總機保持聯系，保證實驗室內外信息的及時溝通。

（6）監控系統

對SPF級動物實驗室的出入口、走道、實驗動物飼養室、功能操作室等重要位置均安裝了可作270°旋轉的攝像機，能夠及時了解設施的運行狀態；也能有效督促實驗人員執行科學的操作規程，避免人為因素造成室內環境和設施的污染；并對整個實驗期間的動物狀態和反應進行觀察，減少對動物的滋擾。

（7）供水系統

SPF級實驗動物飲用水以純凈水為宜。本實驗室采用管道供水，將處理后的純凈水用塑膠管道輸送到屏障系統內實驗準備室，設置接水槽，為實驗動物供應滅菌的飲用水和屏障系統內用水。要經常更換和清洗輸水管道，清洗籠具的用水添加適當比例的84消毒液。

（8）供電系統、警報系統和消防設施

SPF級動物實驗室要求全天候不間斷供風和供電，如果出現故障，不能及時發現和處理，就可能導致環境設施的污染、動物感染或死亡，造成嚴重后果。因此應對SPF級動物實驗室使用獨立穩定的供電系統，并配備有應急電源。在中央空調機房控制室安裝風機故障警報系統，以便及時檢修和維護，保證設施的安全運行。

（9）消毒滅菌設備

為防止外界物品進入SPF級動物實驗室時所攜帶的細菌污染室內環境和造成動物交叉感染，按照不同物品的特性，進行紫外線照射消毒、渡槽消毒液消毒或專用的機動門真空滅菌器消毒。

（10）動物飼養籠具

飼養大、小鼠的籠具聚碳酸脂材料的塑膠籠具，具有高透明、耐高壓、耐高溫、耐酸堿等特點。通用的不銹鋼籠具長、寬、高分別為40、30、20cm，適用于單籠飼養有特殊要求的實驗動物，配有底盤和食槽，確保實驗動物有充足的采食和活動空間，同時也保證室內環境的清潔。

（11）墊料的選擇和使用

在使用塑膠墊料時，墊料是大小鼠直接接觸的鋪墊物，起到吸濕、保暖和造窩的作用。墊料的好壞直接影響到大小鼠術后的恢復、生長發育和繁殖性能。目前，所使用的墊料主要有玉米秸墊料、刨花墊料。

（12）飼料配制

大小鼠的生產型飼料和維持型飼料必須嚴格按照國家標準，進行科學配制生產。每半年檢測一次飼料的微生物指標和有效營養成分指標，保證飼料的質量。

小鼠鑒定結果解讀：

24#, 26#, 27#, 29# KO- PCR 反應可以獲得~700bp條帶； WT- PCR 反應可以獲得324bp 條帶，為雜合子。注：數字為鼠尾號，WT為C57BL/6J野生鼠，N為Nagative空白對照，M為DNA Marker。

① 24#，26#，27#，29#：-12678bp，+13bp/wt，編碼區完全刪除，KO 陽性 agattttaagcaaaggggggaaaattaagc-----12678bp------TAGGGTCAGAATTctagacccctcaccctcctctcctcttacc

② 31#，34#：-12536bp/wt，編碼區完全刪除，KO 陽性 ccaccacccccaattctgacccgatcccgc-----12536bp---agccagcagtgtggatggctagacccctca

③ 32#，33#：-12571bp/wt，編碼區完全刪除，KO 陽性 tccaccaccacccccaattctgacccgatc----12571bp-----cctcctctcctcttacccaagtgcagggtg

1. 項目策略圖

此模型采用CRISPR/Cas9技術對Crtc1基因進行基因編輯，原理示意圖如下：

2. 項目策略概述

利用CRISPR/Cas9技術，設計并體外轉錄gRNA, 將Cas9、gRNA同時注射到小鼠的受精卵中。Cas9蛋白在gRNA引導下結合到靶位點進而造成DNA雙鏈斷裂，從而實現靶位點堿基序列缺失，實現基因敲除。

3. gRNA序列信息

gRNA1: CACGCAAGTCCCAATTGCG (5’ – 3’), PAM: AGG.

gRNA2: CCCTTGCTAGAGATTCCG (5’ – 3’), PAM: AGG.

一、疾病概述 肺結核（Pulmonary tuberculosis，PTB）是世界高死亡率的嚴重傳染病之一。PTB是由各種分支桿菌菌株引起的，結核分支桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）大多在人類中觀察到。根據世界衛生組織（世衛組織）的報告，2017年全世界有1000萬新病例PTB疾病和150萬例死亡（世衛組織，2018年）。 據估計，世界人口的三分之一是潛伏性感染的Mtb，其中5%至10%會發展為活動性結核病。主要癥狀為有較密切的結核病接觸史，起病可急可緩，多為低熱（午后為著）、盜汗、乏力、納差、消瘦、女性月經失調等；呼吸道癥狀有咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、不同程度胸悶或呼吸困難。肺部體征依病情輕重、病變范圍不同而有差異，早期、小范圍的結核不易查到陽性體征，病變范圍較廣者叩診呈濁音，語顫增強，肺泡呼吸音低和濕啰音。晚期結核形成纖維化，局部收縮使胸膜塌陷和縱隔移位。在結核性胸膜炎者早期有胸膜摩擦音，形成大量胸腔積液時，胸壁飽滿，叩診濁實，語顫和呼吸音減低或消失。盡管有微生物治療，多達一半的結核病幸存者仍具有某種形式的持續性肺功能障礙。肺功能障礙，從輕微異常到嚴重氣喘，可增加呼吸道原因死亡的風險。快速診斷和有效治療對于控制PTB的傳播和降低其死亡率非常重要。盡管對PTB的機理研究開展了了大量工作，但PTB進展中的分子機制仍然不清楚。二、模型背景1、Igfbp5基因信息? 敲除基因名稱（NCBI號）：16011? 敲除基因NCBI網址鏈接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/16011? 敲除基因名稱（MGI號）：Igfbp5（MGI: 96440）? 敲除基因Ensembl網址鏈接：? http://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Gene/Summary?g=ENSMUSG00000? 026185;r=1:72857932-72874884? 方案針對的轉錄本（Ensembl號）：ENSMUST00000027377.8? 方案敲除的exon：全部編碼區2、實驗動物背景信息 所采用的小鼠品系為C57BL/6。 來源：1921年立特(Little)用艾比·拉特洛坡(Abby Lathrop)的小鼠株，雌鼠57號與雄鼠52號交配而得C57BL1937年從C57BL分離出C57BL/6和C57BL/10兩個亞系。1985年從Olac引到中國醫學科學院醫學實驗動物研究所。 毛色：黑色。 主要特性：①乳腺腫瘤自然發生率低，化學物質難以誘發乳腺和卵巢腫瘤。②12%有眼睛缺損;雌仔鼠16.8%，雄仔鼠3%為小眼或無眼。用可的松可誘發腭裂，其發生率達20%。③對放射物質耐受力中等;補體活性高;較易誘發免疫耐受性。④對結核桿菌敏感。對鼠痘病毒有一定抵抗力。⑤干擾素產量較高。⑥嗜酒精性高，腎上腺素類脂質濃度低。對百日咳組織胺易感因子敏感。⑦常被認作"標準"的近交系，為許多突變基因提供遺傳背景。主要用途：是腫瘤學、生理學、免疫學、遺傳學研究中常用的品系。3、研究背景 胰島素生長因子結合蛋白（Insulin growth factor binding proteins, IGGBPs）, 系胰島素樣生長因子（insulin growth factors, IGFs）的結合蛋白家族，通過高親和力與IGFs結合調控IGFs發揮生物學功能[1]。研究發現，IGFs 在促進細胞的增殖與分化，調節免疫功能等方面發揮重要的生物作用；而現有的七種IGFBP與IGFs結合，延長IGFs的半衰期，增強或者抑制IGFs的生物學作用[2]。IGFBP5, 分子量為28~30 KD，在大量細胞中均有表達，與IGF1與IGF2有較高的親和力。大量研究發現，IGFBP5與肺組織的發育及部分疾病進程相關。IGFBP5從妊娠第15天開始表達，主要集中在近端氣道上皮細胞、質間充質和周圍血管的間充質，且隨著妊娠的進行而增加，發現IGFBP5在胎兒肺發育過程中至關重要[3] [4]。另有研究報道[5]，IGFBP-5在體外和體內均可誘導胞外基質成分（例如膠原蛋白和纖連蛋白）的產生, 還可誘導原代人肺成纖維細胞遷移而加速肺纖維化進程，可能與MAPK信號通路的激活相關。此外，有相關研究發現miR-19a-19b-20a[6]，熱休克蛋白70[7]在肺纖維化中的作用可能與介導了IGFBP5相關。大量研究表明IGFBP5與肺癌的發生及患者預后情況密切相關。有研究[8]發現在肺鱗狀細胞癌（SCC）中差異表達的基因，IGFBP5在肺腫瘤組織和十個正常支氣管上皮組織中存在顯著的表達差異。有研究采用生物信息學分析發現[9]： IGFBP5是轉移性骨肉瘤中表達下調最顯著的基因之一，深入過表達、敲低實驗驗證IGFBP5抑制了骨肉瘤體外細胞增殖，遷移和侵襲，且敲低IGFBP5后能逆轉腫瘤的進程。有研究發現[10] circPIP5K1A通過靶向miR-661 / IGFBP5軸促進了卵巢癌的發展，間接表明IGFBP5在腫瘤中的作用及成為治療靶點的臨床意義。 因此，本課題與采用模型，探究IGFBP5在肺結核疾病中的潛在作用及分子機制，旨在為肺結核篩選疾病分子標志物與尋求潛在治療靶點。參考文獻：1. Stiles, A.D. and A.J. D'Ercole, The insulin-like growth factors and the lung. Am J Respir Cell Mol Biol, 1990. 3(2): p. 93-100.2. Cohick, W.S. and D.R. Clemmons, The insulin-like growth factors. Annu Rev Physiol, 1993. 55: p. 131-53.3. Retsch-Bogart, G.Z., et al., Cellular localization of messenger RNAs for insulin-like growth factors (IGFs), their receptors and binding proteins during fetal rat lung development. Am J Respir Cell Mol Biol, 1996. 14(1): p. 61-9.4. Price, W.A., et al., Insulin-like growth factor binding protein production and regulation in fetal rat lung cells. Am J Respir Cell Mol Biol, 1993. 8(4): p. 425-32.5. Yasuoka, H., Y. Yamaguchi, and C.A. Feghali-Bostwick, The pro-fibrotic factor IGFBP-5 induces lung fibroblast and mononuclear cell migration. Am J Respir Cell Mol Biol, 2009. 41(2): p. 179-88.6. Souma, K., et al., Lung fibroblasts express a miR-19a-19b-20a sub-cluster to suppress TGF-beta-associated fibroblast activation in murine pulmonary fibrosis. Sci Rep, 2018. 8(1): p. 16642.7. Sellares, J., et al., Intracellular Heat Shock Protein 70 Deficiency in Pulmonary Fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol, 2019. 60(6): p. 629-636.8. Liu, Y., et al., Identification of genes differentially expressed in human primary lung squamous cell carcinoma. Lung Cancer, 2007. 56(3): p. 307-17.9. Su, Y., et al., Insulin-like growth factor binding protein 5 suppresses tumor growth and metastasis of human osteosarcoma. Oncogene, 2011. 30(37): p. 3907-17.10. Sun, Y., et al., circPIP5K1A serves as a competitive endogenous RNA contributing to ovarian cancer progression via regulation of miR-661/IGFBP5 signaling. J Cell Biochem, 2019. 120(12): p. 19406-19414.