Nipsnap1基因敲除肺結核小鼠模型

Nipsnap1基因敲除小鼠模型，采用的是基于CRISPR/Cas9技術的完全性基因敲除（Conventional Knockout,KO）。完全性基因敲除是把敲除目的基因的所有外顯子或幾個總要的外顯子功能區敲除掉，獲得全身所有的組織和細胞中都不表達該基因的小鼠模型。Armh4基因敲除小鼠模型為完全性基因敲除模型（KO），該模型應用范圍廣，可以制造針對各類疾病不同組織器官細胞的疾病模型。

CRISPR/Cas9技術的優點在于其對基因進行定位的精準編輯，在向導RNA（guide RNA，gRNA）和Cas9蛋白的共同作用下，細胞基因組DNA（被看成外源DNA）將被準確剪切。但是，被CRISPR/Cas9剪切需要滿足幾個條件。第一，待編輯的區域附近需要存在相對保守的PAM序列（NGG）。第二，向導RNA要與PAM上游的序列堿基互補配對。

模型動物飼養在武漢大學人民醫院動物房SPF級動物實驗室，實驗動物使用許可證SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特點

門采用專用凈化密閉門并配備觀察窗。單向走道呈順時針走向設計。屏障系統內共有大鼠飼養室1間，小鼠飼養室3間，隔離觀察室1間，實驗準備室1間，潔物存放室1間，清洗消毒室1間。此外，屏障系統外配有監控室、機房和配電室等。

（2）設計參數

室內溫度：20～26°C；日溫差：≤4°C；相對濕度：40%～70%；換氣次數：15～20次/h；氣流速度：≤0．2m/s；壓強梯度：20～50Pa；空氣潔凈度：7級；菌落數：≤3個/皿；氨濃度：≤14mg/m3；噪聲：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；動物照度：15～20lx；晝夜明暗交替時間：12/12h。

（3）通風和空調系統

動物實驗室采用全新風中央空調通風系統。空氣經過初、中、三級過濾器后進入實驗室內環境。

（4）照明系統

一更、淋浴、二更、氣閘、清潔走道、潔物存放處、污物走道、緩沖間和清洗消毒間、動物飼養室、實驗準備間、隔離觀察室和功能實驗室等安裝有手動和自動開關，根據實際需要，調節控制室內照明燈。未啟用房間、清潔走道、潔物存放處、污物走道等在每日中午12點和晚上8點開啟紫外線燈照射1h。

（5）通訊系統

因為SPF級動物實驗室的環境和設施具有特殊要求，人員進入后不能隨意出入，而室內外的聯系又十分重要，故室內各房間均安裝內部電話機，按照房間順序編排電話號碼，各室內電話可相互連通，并均與監控室總機保持聯系，保證實驗室內外信息的及時溝通。

（6）監控系統

對SPF級動物實驗室的出入口、走道、實驗動物飼養室、功能操作室等重要位置均安裝了可作270°旋轉的攝像機，能夠及時了解設施的運行狀態；也能有效督促實驗人員執行科學的操作規程，避免人為因素造成室內環境和設施的污染；并對整個實驗期間的動物狀態和反應進行觀察，減少對動物的滋擾。

（7）供水系統

SPF級實驗動物飲用水以純凈水為宜。本實驗室采用管道供水，將處理后的純凈水用塑膠管道輸送到屏障系統內實驗準備室，設置接水槽，為實驗動物供應滅菌的飲用水和屏障系統內用水。要經常更換和清洗輸水管道，清洗籠具的用水添加適當比例的84消毒液。

（8）供電系統、警報系統和消防設施

SPF級動物實驗室要求全天候不間斷供風和供電，如果出現故障，不能及時發現和處理，就可能導致環境設施的污染、動物感染或死亡，造成嚴重后果。因此應對SPF級動物實驗室使用獨立穩定的供電系統，并配備有應急電源。在中央空調機房控制室安裝風機故障警報系統，以便及時檢修和維護，保證設施的安全運行。

（9）消毒滅菌設備

為防止外界物品進入SPF級動物實驗室時所攜帶的細菌污染室內環境和造成動物交叉感染，按照不同物品的特性，進行紫外線照射消毒、渡槽消毒液消毒或專用的機動門真空滅菌器消毒。

（10）動物飼養籠具

飼養大、小鼠的籠具聚碳酸脂材料的塑膠籠具，具有高透明、耐高壓、耐高溫、耐酸堿等特點。通用的不銹鋼籠具長、寬、高分別為40、30、20cm，適用于單籠飼養有特殊要求的實驗動物，配有底盤和食槽，確保實驗動物有充足的采食和活動空間，同時也保證室內環境的清潔。

（11）墊料的選擇和使用

在使用塑膠墊料時，墊料是大小鼠直接接觸的鋪墊物，起到吸濕、保暖和造窩的作用。墊料的好壞直接影響到大小鼠術后的恢復、生長發育和繁殖性能。目前，所使用的墊料主要有玉米秸墊料、刨花墊料。

（12）飼料配制

大小鼠的生產型飼料和維持型飼料必須嚴格按照國家標準，進行科學配制生產。每半年檢測一次飼料的微生物指標和有效營養成分指標，保證飼料的質量。

Nipsnap1缺失小鼠鑒定結果圖：

圖1.Nipsnap1缺失小鼠鑒定結果。

通過送測序，鑒定。雜合子：一條缺失8bp，為雙峰；純和子：兩條缺失8bp，為單峰。

1.guideRNA設計

guideRNA信息:

Nipsnap1（ko） -sgRNA1： CCACAAGGTGGATCCTCGGAAGG

Nipsnap1（ko） -sgRNA1： CAACGTGAAGCCCGAATGTCTGG

一、疾病概述

肺結核（Pulmonary tuberculosis，PTB）是世界高死亡率的嚴重傳染病之一。PTB是由各種分支桿菌菌株引起的，結核分支桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）大多在人類中觀察到。根據世界衛生組織（世衛組織）的報告，2017年全世界有1000萬新病例PTB疾病和150萬例死亡（世衛組織，2018年）。 據估計，世界人口的三分之一是潛伏性感染的Mtb，其中5%至10%會發展為活動性結核病。

主要癥狀為有較密切的結核病接觸史，起病可急可緩，多為低熱（午后為著）、盜汗、乏力、納差、消瘦、女性月經失調等；呼吸道癥狀有咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、不同程度胸悶或呼吸困難。肺部體征依病情輕重、病變范圍不同而有差異，早期、小范圍的結核不易查到陽性體征，病變范圍較廣者叩診呈濁音，語顫增強，肺泡呼吸音低和濕啰音。晚期結核形成纖維化，局部收縮使胸膜塌陷和縱隔移位。在結核性胸膜炎者早期有胸膜摩擦音，形成大量胸腔積液時，胸壁飽滿，叩診濁實，語顫和呼吸音減低或消失。 盡管有微生物治療，多達一半的結核病幸存者仍具有某種形式的持續性肺功能障礙。肺功能障礙，從輕微異常到嚴重氣喘，可增加呼吸道原因死亡的風險。快速診斷和有效治療對于控制PTB的傳播和降低其死亡率非常重要。盡管對PTB的機理研究開展了了大量工作，但PTB進展中的分子機制仍然不清楚。二、模型背景1、Nipsnap1基因信息? 敲除基因名稱（NCBI號）：18082? 敲除基因NCBI網址鏈接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/18082? 敲除基因名稱：Nipsnap1? 敲除基因Ensembl網址鏈接：http://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Gene/Summary?db=core;g=ENSMUSG00000034285;r=11:4873951-4894200? 方案針對的轉錄本（Ensembl號）：ENSMUSG000000342852、實驗動物背景信息所采用的小鼠品系為C57BL/6。來源：1921年立特(Little)用艾比·拉特洛坡(Abby Lathrop)的小鼠株，雌鼠57號與雄鼠52號交配而得C57BL1937年從C57BL分離出C57BL/6和C57BL/10兩個亞系。1985年從Olac引到中國醫學科學院實驗動物研究所。毛色：黑色。主要特性：①乳腺腫瘤自然發生率低，化學物質難以誘發乳腺和卵巢腫瘤。②12%有眼睛缺損;雌仔鼠16.8%，雄仔鼠3%為小眼或無眼。用可的松可誘發腭裂，其發生率達20%。③對放射物質耐受力中等;補體活性高;較易誘發免疫耐受性。④對結核桿菌敏感。對鼠痘病毒有一定抵抗力。⑤干擾素產量較高。⑥嗜酒精性高，腎上腺素類脂質濃度低。對百日咳組織胺易感因子敏感。⑦常被認作"標準"的近交系，為許多突變基因提供遺傳背景。主要用途：是腫瘤學、生理學、免疫學、遺傳學研究中常用的品系。3、研究背景 迄今已鑒定4個NIPSNAP家族蛋白：NIPSNAP-1和-2以及NIPSNAP-3和-4。NIPSNAP家族蛋白含有兩個結構域：4-硝基苯磷酸酶域和非神經性SNAP25類蛋白質同源結構域。研究主要涉及癲癇發作，苯基酮尿癥，和阿爾茨海默病等。NIPSNAP-1在大腦中的高水平上表達，肝臟和腎臟(1-3)。比對多個物種的NIPSNAP家族基因序列，揭示了NIPSNAP家族基因序列的高度保守性，提示其關鍵生物學功能。 NIPSNAP-1可局部化到外線粒體膜和內膜空間，并與細胞索蛋白（如P62/SQSTM-1和ATG8s(4)相互作用。因此，NIPSNAP-1可充當支架蛋白，在先天免疫反應期間在線粒體相關信號轉導中發揮作用。與炎癥相關的慢性疼痛是一個重要的臨床問題，其基本機制仍然缺乏理解。NIPSNAPs表達的變化可能有助于炎癥性疼痛的發病機制(5)。 研究表明線粒體蛋白NIPSNAP -1和-2和長鏈acyl-CoA脫氫酶（VLCAD）作為抗生素clarithromycin結合蛋白。在人類上皮細胞系BEAS-2B和T24中，由脂質多糖和Pam3-CSK4誘導的致炎細胞因子（IL-8和IL-6）的產生被NIPSNAP-1或-2 的所抑制。此外，在各種細胞系中敲除NIPSNAP-1抑制了IL-8和IL-6 mRNA和NF-βB活性的LPS誘導表達(6)。參考文獻：1. Nautiyal M, Sweatt AJ, MacKenzie JA, Mark Payne R, Szucs S, Matalon R, Wallin R, Hutson SM. Neuronal localization of the mitochondrial protein NIPSNAP1 in rat nervous system. Eur J Neurosci. 2010 Aug;32:560-9.2. Seroussi E, Pan HQ, Kedra D, Roe BA, Dumanski JP. Characterization of the human NIPSNAP1 gene from 22q12: a member of a novel gene family. Gene. 1998 May 28;212:13-20.3. Schoeber JP, Topala CN, Lee KP, Lambers TT, Ricard G, van der Kemp AW, Huynen MA, Hoenderop JG, Bindels RJ. Identification of Nipsnap1 as a novel auxiliary protein inhibiting TRPV6 activity. Pflugers Arch. 2008 Oct;457:91-101.4. Behrends C, Sowa ME, Gygi SP, Harper JW. Network organization of the human autophagy system. Nature. 2010 Jul 1;466:68-76.5. Okuda-Ashitaka E, Minami T, Tsubouchi S, Kiyonari H, Iwamatsu A, Noda T, Handa H, Ito S. Identification of NIPSNAP1 as a nocistatin-interacting protein involving pain transmission. J Biol Chem. 2012 Mar 23;287:10403-13.6. Yamamoto S, Ogasawara N, Yamamoto K, Uemura C, Takaya Y, Shiraishi T, Sato T, Hashimoto S, Tsutsumi H, et al. Mitochondrial proteins NIP-SNAP-1 and -2 are a target for the immunomodulatory activity of clarithromycin, which involves NF-kappaB-mediated cytokine production. Biochem Biophys Res Commun. 2017 Feb 12;483:911-6.