Isca1心肌特異性基因敲除SD大鼠模型

Isca1是最近發現的多發性線粒體功能障礙綜合征（MMDS）的致病基因，目前已有研究發現Isca1在線粒體以及胞質鐵硫簇生物合成過程中起重要作用，而鐵硫簇最重要的生物學功能是作為電子傳遞蛋白的輔助基團參與能量轉移。

所以推測Isca1基因對機體線粒體功能及能量代謝進程具有重要作用，而心臟作為機體內重要高耗能臟器，Isca1基因對心臟發育，能量代謝及病理進程可能具有重要作用。

然而，目前還沒有該基因心肌特異性敲除大鼠模型的建立及研究報道，所以特構建該模型大鼠，以分析Isca1基因對心臟發育的影響及其生物學功能，為新的心肌能量代謝異常和由心肌線粒體功能障礙導致的心衰大鼠模型的建立提供實驗依據。

已構建成功的心肌特異性敲除純合子大鼠模型，出生后7-10天即陸續死亡，至出生后11天生存率為0%，至6.5天時小鼠心臟整體擴張嚴重，心功能下降顯著，表現為嚴重心衰癥狀，心肌纖維斷裂溶解，心肌線粒體腫脹，嵴消失，空化嚴重。推測該模型大鼠由Isca1基因缺失后導致線粒體功能障礙，進而引發心衰及死亡。

該模型對于Isca1基因的生物學功能研究，特別是其對心肌線粒體功能的影響及機制分析提供了工具動物，并且可成為由心肌線粒體功能障礙導致心衰的工具動物模型。但是該動物模型發病較早，限制了部分實驗的實施和后續研究。

SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司【SCXK（京）2012-001】。實驗中涉及動物的操作程序已獲得中國醫學科學院醫學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準，批準號為ZLF18003.

4.1 心肌組織特異性Isca1敲除大鼠模型的建立

利用Cre/loxP重組系統的原理，進行條件性敲除（Conditionalknockout，CKO），制備心肌組織特異性Isca1敲除大鼠。在Isca1基因第三外顯子兩端插入兩個loxP位點來構建Isca1flox/+大鼠，使其與αMHC-Cre大鼠進行雜交，經兩輪雜交最終獲得Isca1flox/flox/MHC-Cre大鼠，通過PCR方法進行基因型鑒定心肌組織特異性Isca1敲除大鼠基因型。免疫印跡Westernblot方法鑒定Isca1flox/flox/MHC-Cre大鼠ISCA1蛋白的敲除效率達90%以上（圖3）。

圖3 心肌組織特異性Isca1敲除大鼠模型基因型鑒定及基因蛋白表達水平鑒定

4.2 心肌組織特異性Isca1敲除大鼠生存率分析

為觀察心肌組織特異性Isca1敲除大鼠子代基因型及生存率情況，將 Isca1flox/+大鼠與MHC-Cre大鼠經兩代雜交，得到野生型（WT）、心肌特異性Isca1敲除大鼠雜合子（Isca1flox/+/MHC-Cre）和心肌特異性Isca1敲除大鼠純合子（Isca1flox/flox/MHC-Cre）幼崽，根據孟德爾定律，上述基因型比例應為5：2：1，實驗結果顯示，累積統計幼崽共127只，其中WT幼崽74只，Isca1flox/+/MHC-Cre 幼崽37只，Isca1flox/flox/MHC-Cre幼崽16只，經計算可得子代中野生型、雜合子型、純合子型三種基因型幼崽出生比例基本符合孟德爾定律（圖4）。對三種基因型子代進行生存率分析顯示，子代中WT和Isca1flox/+/MHC-Cre幼崽生存正常，生存率為100%，Isca1flox/flox/MHC-Cre幼崽7~10天全部死亡，至11天生存率為0%（圖4）。

圖4 心肌組織特異性Isca1敲除大鼠生存率分析

注：（A）Isca1flox/+大鼠與Isca1flox/+/MHC-Cre大鼠雜交后，出生子代基因型情況統計。（B）Isca1flox/+大鼠與Isca1flox/+/MHC-Cre大鼠雜交后，WT和Isca1flox/flox/MHC-Cre子代生存率統計。

4.3 心肌組織特異性Isca1敲除大鼠心臟重量/體重比分析

使 Isca1flox/+大鼠與Isca1flox/+/MHC-Cre大鼠雜交，于子代出生后6.5天對WT和Isca1flox/flox/MHC-Cre（CKO）子代進行大體形態觀察并計算心臟重量與體重之比（heartweight/body weight，HW/BW）。實驗結果，與野生型相比，6.5 d CKO大鼠呼吸虛弱，處于瀕臨死亡狀態（圖5），并且心臟外觀出現明顯肥大。6.5d CKO大鼠HW/BW平均值±標準差為（8.11± 1.85）mg/g，較6.5d WT大鼠（平均值±標準差為（6.50± 1.01） mg/g）顯著增加，有顯著性差異（圖5，*P<0.05）。

圖 5 心肌組織特異性Isca1敲除大鼠HW/BW比率分析

4.4 M型超聲心動圖檢測6.5 d心肌特異性Isca1敲除大鼠心臟的結構和功能

為分析心臟結構與功能狀態改變，本研究通過M型超聲心動圖檢測6.5d 野生和心肌組織特異性敲除大鼠心臟的結構和功能。發現與同窩WT大鼠相比，6.5dKO大鼠射血分數大幅下降，左心室內徑明顯增大，伴隨室壁變薄，表現為收縮無力，心室嚴重擴張，已出現心功能下降、嚴重心衰的癥狀。

表1. 6.5 d心肌組織特異性Isca1敲除大鼠心臟M型超聲影像參數分析

注：左心室舒張末期內徑（leftventricular end-diastolic diameter，LVID;d）；左心室收縮末期內徑（left ventricular end-systolic diameter，LVID;s）；射血分數（ejection fraction，EF）；短軸縮短率（fractional shortening，FS）；舒張期左心室后壁厚度（left ventricular posterior wall; diastolic，LVPW;d）；收縮期左心室后壁厚度（left ventricular posterior wall; systolic，LVPW;s）；舒張期左心室前壁厚度（left ventricular anterior wall; diastolic，LVAW;d）；收縮期左心室前壁厚度（left ventricular anterior wall; systolic，LVAW;s）。*P<0.05，**P<0.01，versus同窩WT大鼠。

4.5 心肌組織特異性Isca1敲除大鼠心肌纖維及線粒體形態觀察

為進一步分析心肌組織特異性Isca1敲除大鼠心肌纖維和線粒體形態改變，取6.5天WT和心肌組織特異性Isca1敲除大鼠，摘取心臟，取左心室2mm×2 mm大小新鮮組織，使用電鏡專用固定液進行固定，制備電鏡樣本并進行觀察。結果顯示，WT大鼠心肌纖維排列整齊，肌節和Z線清晰，心肌內線粒體多呈圓形或橢圓形，線粒體雙層膜膜結構清晰，嵴致密。而6.5天心肌組織特異性Isca1大鼠敲除心肌纖維出現斷裂，肌節和Z線嚴重模糊，部分位置纖維已溶解，心肌內線粒體膜結構受損，線粒體內嵴結構消失，線粒體腫脹及空化嚴重（圖6）。

圖6心肌組織特異性Isca1敲除大鼠超微結構形態觀察

3.1 實驗材料

3.1.1 實驗動物

SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司【SCXK（京）2012-001】。實驗中涉及動物的操作程序已獲得中國醫學科學院醫學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準，批準號為ZLF18003.

3.1.2實驗儀器

3.1.3實驗試劑

3.1.4 模型構建流程 利用Cre/loxP重組系統的原理，進行條件性敲除（Conditional knockout，CKO），制備心肌組織特異性Isca1敲除大鼠。在Isca1基因第三外顯子兩端插入兩個loxP位點來構建Isca1flox/+大鼠，使其與αMHC-Cre大鼠進行雜交，經兩輪雜交最終獲得Isca1flox/flox/MHC-Cre大鼠，并使用PCR方法進行基因型鑒定，使用Western blot技術進行敲除效率的鑒定。3.1.5 Isca1條件性敲除大鼠及心肌組織特異性Isca1敲除大鼠的建立3.1.5.1 Isca1條件性敲除大鼠模型的建立

圖 1. Isca1條件性敲除模型構建設計方案

(2) 構建sgRNA 載體pUC57-sgRNA expressionvector，根據基因信息選擇靶點并合成sgRNA。

靶點1:

GCCTCCTGAGCAAGTGCT GGG

R-ISCA1-gRNAUP1 5’TAGGGCCTCCTGAGCAAGTGCT

R-ISCA1-gRNADOWN1 5’AAACAGCACTTGCTCAGGAGGC

靶點2:

AGCCCTGAACTCCTTATG TGG

R-ISCA1-gRNAUP2 5’TAGGAGCCCTGAACTCCTTATG

R-ISCA1-gRNADOWN2 5’AAACCATAAGGAGTTCAGGGCT

(3) 合成的sgRNA單鏈通過退火復性結合成小片段，插入BSA I線性化的載體，構建完成的sgRNA載體通過體外轉錄成為可注射的sgRNA。

(4) 構建Cas9載體pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，載體通過體外轉錄成為可注射的Cas9-RNA。

(5) 顯微注射

1) 超數排卵：15只3-4周齡SD雌鼠注射激素進行超排。

2) 受精卵注射：取約150枚受精卵進行注射。

3) 雄鼠結扎：制作30只8周齡輸精管結扎的SD雄鼠。

4) 受體鼠制備：8-10周齡SD雌鼠與結扎的SD雄鼠交配后選取見栓的雌鼠。

5) 胚胎移植：將注射后的受精卵移植到受體鼠輸卵管壺腹部（移植一次，150枚卵，5只受體鼠）。

(6) 基因型鑒定

1) 剪尾編號：出生7-10天的乳鼠，剪取腳趾和尾尖進行編號及取材。

2) 基因組DNA提取：使用基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA

3) PCR檢測：根據序列信息設計檢測引物并進行PCR檢測。

(7) 結果分析：選取通過PCR檢測后含有不同于野生型分子量條帶的鼠號，將PCR產物進行TA克隆，之后用檢測引物進行菌液PCR，篩選有插入的克隆測序。

(8) 根據測序結果確定Isca1條件性敲除模型大鼠（SD. Isca1 (tm-loxp)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）用于后續實驗。

3.1.5.2 心肌組織特異性Isca1敲除大鼠（Isca1flox/flox/MHC-Cre）的建立

根據3.1.5.1獲得Isca1flox/+大鼠F1代后，首先通過8周齡左右Isca1flox/+與野生型大鼠進行雜交，獲得一定數量的Isca1flox/+大鼠。與此同時使8周齡左右Isca1flox/+大鼠與αMHC-Cre大鼠（SD.Tg(MHC-CRE)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）進行雜交，得到Isca1flox/+/MHC-Cre大鼠。之后使8周齡左右Isca1flox/+大鼠與Isca1flox/+/MHC-Cre大鼠進行第二輪雜交，可得到Isca1flox/flox/MHC-Cre大鼠，即心肌組織特異性Isca1敲除純合子大鼠，用于后續實驗。

圖2.Isca1flox/flox/MHC-Cre大鼠的繁育

3.1.5.3 鼠尾基因組DNA提取

在幼崽出生后剪腳趾標記，收集幼崽腳趾至1.5 mL EP管。然后參照DNA提取試劑盒說明書按以下程序操作。

(1) 加入100μL LB2和20 μL Proteinase K，55℃搖床孵育至完全裂解。

(2) 12000rpm 離心5min，轉移上清于一無菌的離心管中。

(3) 加入500μLBB2，立即渦旋5s，室溫孵育10min。

(4) 將全部的溶液加入離心柱中，8000rpm離心1min，棄掉流出液。

(5) 加入500μL CB2溶液，12000 rpm離心1min，棄掉流出液。

(6) 重復步驟（5）一次。

(7) 加入500μL WB2（使用前加入88 mL無水乙醇），12000rpm 離心1min，棄掉流出液。

(8) 重復步驟（7）一次。

(9) 10000rpm 離心2min，徹底去除殘留的WB2。

(10) 將離心柱置于一干凈的離心管中，開蓋靜置5min，在柱的中央加入50~200μL預熱EB（60℃~70℃），蓋上蓋子，室溫靜置3min，12000rpm 離心2min，洗脫DNA。保存至4℃冰箱。

一、疾病概述

心力衰竭，簡稱心衰，是指由于心臟收縮和（或）舒張功能障礙，無法將靜脈回心血量充分排出心臟，導致靜脈系統血液淤積，動脈系統灌注不足，從而引發心臟循環障礙癥候群，心衰并不是一個獨立的疾病，而是所有心血管疾病發展的終末階段。

近年來，隨著我國社會老齡化和高血壓，冠心病等心血管疾病發病率的增加，使得心衰呈現高發病率，高致殘率和高死亡率的特點，《2018中國心力衰竭診斷和治療指南》中報道我國心衰患病率為0.9%，有1000萬左右的心衰患者。

幾乎所有的心血管疾病最終都會導致心衰的發生，而在基礎性心臟病的基礎上，一些因素亦可誘發心衰的發生，常見誘因包括，感染，嚴重心律失常，心臟負荷增大，藥物中毒（如洋地黃）等等。

心衰在臨床上可分為急性心衰和慢性心衰。臨床表現，包括呼吸困難，運動耐力下降，心室腔增大，心臟功能下降（LVEF<40-50%），心臟順應性降低，心室腔內淤血，肺循環及體循環淤血。

臨床檢查手段，包括超聲影像分析，心電圖，心衰標志物（B型利鈉肽（BNP），N末端B型利鈉肽原（NT-proBNP））心肌壞死標志物（心肌肌鈣蛋白T（cTnT）及心肌肌鈣蛋白I（cTnI））。

臨床治療方法，包括強心（米力農，地高辛），利尿（速尿），抗感染，改善心肌重構（卡維地洛）及心臟移植。

二、模型背景

1、xx（細胞/基因/病原/其他造模因素）信息

2、實驗動物背景信息

SD大鼠

3、研究背景

Isca1是最近發現的多發性線粒體功能障礙綜合征（MMDS）的致病基因，目前已有研究發現Isca1在線粒體以及胞質鐵硫簇生物合成過程中起重要作用，而鐵硫簇最重要的生物學功能是作為電子傳遞蛋白的輔助基團參與能量轉移【1-6】。

所以推測Isca1基因對機體線粒體功能及能量代謝進程具有重要作用，而心臟作為機體內重要高耗能臟器，Isca1基因對心臟發育，能量代謝及病理進程可能具有重要作用。

目前還沒有該基因心肌特異性敲除大鼠模型的建立及研究報道，所以特構建該模型大鼠，以分析Isca1基因對心臟發育的影響及其生物學功能，為新的心肌能量代謝異常和由心肌線粒體功能障礙導致的心衰大鼠模型的建立提供實驗依據。

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