全身性Lep基因敲除小鼠模型

Lep基因缺失導致小鼠自發性肥胖，基因敲除的純合子小鼠具有肥胖、嗜食、活性低、代謝效率高、產熱受損、不孕和壽命短等表型，體重達到正常小鼠的三倍，影響糖尿病的嚴重程度和病程。與高脂飲食誘導的肥胖(DIO)小鼠相比，Lep基因敲除小鼠表現出不受調節的進食(貪食)，這導致肥胖、糖尿病和比DIO小鼠癥狀更為嚴重的疾病。

模型動物飼養在武漢大學人民醫院動物房SPF級動物實驗室，實驗動物使用許可證SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特點

門采用專用凈化密閉門并配備觀察窗。單向走道呈順時針走向設計。屏障系統內共有大鼠飼養室1間，小鼠飼養室3間，隔離觀察室1間，實驗準備室1間，潔物存放室1間，清洗消毒室1間。此外，屏障系統外配有監控室、機房和配電室等。

（2）設計參數

室內溫度：20～26°C；日溫差：≤4°C；相對濕度：40%～70%；換氣次數：15～20次/h；氣流速度：≤0．2m/s；壓強梯度：20～50Pa；空氣潔凈度：7級；菌落數：≤3個/皿；氨濃度：≤14mg/m3；噪聲：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；動物照度：15～20lx；晝夜明暗交替時間：12/12h。

（3）通風和空調系統

動物實驗室采用全新風中央空調通風系統。空氣經過初、中、三級過濾器后進入實驗室內環境。

（4）照明系統

一更、淋浴、二更、氣閘、清潔走道、潔物存放處、污物走道、緩沖間和清洗消毒間、動物飼養室、實驗準備間、隔離觀察室和功能實驗室等安裝有手動和自動開關，根據實際需要，調節控制室內照明燈。未啟用房間、清潔走道、潔物存放處、污物走道等在每日中午12點和晚上8點開啟紫外線燈照射1h。

（5）通訊系統

因為SPF級動物實驗室的環境和設施具有特殊要求，人員進入后不能隨意出入，而室內外的聯系又十分重要，故室內各房間均安裝內部電話機，按照房間順序編排電話號碼，各室內電話可相互連通，并均與監控室總機保持聯系，保證實驗室內外信息的及時溝通。

（6）監控系統

對SPF級動物實驗室的出入口、走道、實驗動物飼養室、功能操作室等重要位置均安裝了可作270°旋轉的攝像機，能夠及時了解設施的運行狀態；也能有效督促實驗人員執行科學的操作規程，避免人為因素造成室內環境和設施的污染；并對整個實驗期間的動物狀態和反應進行觀察，減少對動物的滋擾。

（7）供水系統

SPF級實驗動物飲用水以純凈水為宜。本實驗室采用管道供水，將處理后的純凈水用塑膠管道輸送到屏障系統內實驗準備室，設置接水槽，為實驗動物供應滅菌的飲用水和屏障系統內用水。要經常更換和清洗輸水管道，清洗籠具的用水添加適當比例的84消毒液。

（8）供電系統、警報系統和消防設施

SPF級動物實驗室要求全天候不間斷供風和供電，如果出現故障，不能及時發現和處理，就可能導致環境設施的污染、動物感染或死亡，造成嚴重后果。因此應對SPF級動物實驗室使用獨立穩定的供電系統，并配備有應急電源。在中央空調機房控制室安裝風機故障警報系統，以便及時檢修和維護，保證設施的安全運行。

（9）消毒滅菌設備

為防止外界物品進入SPF級動物實驗室時所攜帶的細菌污染室內環境和造成動物交叉感染，按照不同物品的特性，進行紫外線照射消毒、渡槽消毒液消毒或專用的機動門真空滅菌器消毒。

（10）動物飼養籠具

飼養大、小鼠的籠具聚碳酸脂材料的塑膠籠具，具有高透明、耐高壓、耐高溫、耐酸堿等特點。通用的不銹鋼籠具長、寬、高分別為40、30、20cm，適用于單籠飼養有特殊要求的實驗動物，配有底盤和食槽，確保實驗動物有充足的采食和活動空間，同時也保證室內環境的清潔。

（11）墊料的選擇和使用

在使用塑膠墊料時，墊料是大小鼠直接接觸的鋪墊物，起到吸濕、保暖和造窩的作用。墊料的好壞直接影響到大小鼠術后的恢復、生長發育和繁殖性能。目前，所使用的墊料主要有玉米秸墊料、刨花墊料。

（12）飼料配制

大小鼠的生產型飼料和維持型飼料必須嚴格按照國家標準，進行科學配制生產。每半年檢測一次飼料的微生物指標和有效營養成分指標，保證飼料的質量。

全身性lep基因敲除小鼠采用PCR方式進行鑒定。

（1）引物信息：見表4

（2）PCR結果：見圖1-5#、7-10#小鼠PCR結果符合要求，需進一步測序鑒定。

圖2. F/R 檢測Lep基因刪除情況

（3）測序結果：通過峰形分析，可以將突變型的DNA 序列（紅色箭頭所指峰形）分析出來。結果為AGGAGGGGCCAGCC 前的缺失約3162bp,發生片段敲除。具體見圖3。說明全身性Lep基因敲除小鼠構建成功。

模型背景：C57BL/6J小鼠

模型制作方法：

（1）根據Lep 的基因組序列結構，設計CRISPR 靶點：

根據目前基因組數據，Lep 基因存在2 個轉錄產物，見下圖：

http://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Gene/Summary?db=core;g=ENSMUSG00000059201;r=6:29060220-29073877

Lep 保守區域分析：

根據Lep 基因組結構和蛋白功能保守區，Lep 有2 個轉錄產物。選取Lep-201進行設計，Exon2-3(aa1-167)，為編碼蛋白的轉錄產物的外顯子,而且也是Lep 基因所有轉錄本Lep-202 的全部的外顯子序列，刪除這Exon2-3 后，翻譯該蛋白的mRNA 將不會被轉錄出來，而且該基因被完全敲除。因此決定在Exon2-3 的兩邊設計靶點，實現Exon2-3 敲除。

下面將根據Exon8 設計條件性敲除方案。

轉錄產物Lep-201 的基因組結構：

（2）F0 代構建及繁殖：

基因敲除構建設計。

肥胖是指身體超重，脂肪異常堆積的狀態。肥胖與多種疾病有關，如糖尿病、某些癌癥、高血壓和心血管疾病。肥胖一直被認為是由個人習慣造成的，主要是熱量攝入過多和缺乏鍛煉。此外，遺傳成分，如遺傳缺陷和遺傳變異，包括瘦素基因突變，也可能對超重和肥胖的發展有強大的作用等。瘦蛋白是一種由白色脂肪細胞、骨骼肌、胎盤和垂體等組織產生的激素，主要由脂肪組織分泌；影響下丘腦，調節食欲和能量平衡，從而導致體重增加。同時，瘦蛋白對于維持垂體GH細胞及其功能也很重要。當促生長激素細胞的瘦蛋白受體發生缺失，則導致GH細胞數量減少、循環生長激素減少，最終引起成體性肥胖。Lep基因缺失導致小鼠自發性肥胖，基因敲除的純合子小鼠具有肥胖、嗜食、活性低、代謝效率高、產熱受損、不孕和壽命短等表型，體重達到正常小鼠的三倍，影響糖尿病的嚴重程度和病程。與高脂飲食誘導的肥胖(DIO)小鼠相比，Lep基因敲除小鼠表現出不受調節的進食(貪食)，這導致肥胖、糖尿病和比DIO小鼠癥狀更為嚴重的疾病。