酪氨酸酶基因敲除白化西藏小型豬

常用的實驗動物一般都有對應的白變種品系，如BALB/c小鼠、SD大鼠、白化豚鼠、新西蘭大白兔等，能滿足特定實驗需求。為了更好地使西藏小型豬滿足科研實驗需求，本單位通利用CRISPR/Cas9受精卵注射法獲得了TYR基因敲除白化西藏小型豬。該方法可有效避免了體細胞核移植法所引起的胚胎發育延遲、出生后存活率低、同一細胞克隆株所獲得的性別單一等問題。此外，受精卵由胞質內注射法所獲得的F0代并不攜帶外源豬種的線粒體DNA，很好地保留了西藏小型豬的其他特性。外觀上看，白化西藏小型豬和普通西藏小型豬，除了眼睛和皮毛發顏色不一樣外，其他無太大差別。TYR基因敲除西藏小型豬，因黑色素合成障礙，導致全身皮膚和毛發呈白色，眼睛呈紅色，呈典型的白化癥狀。與野生型西藏小型豬相比，白化西藏小型豬的耳緣靜脈更加清晰，利于實驗時靜脈注射給藥。白化西藏小型豬的皮膚在進行炎癥和損傷觀察時更加清晰，且還可很方便地在其皮膚或毛發上做標記。

由于白化病為隱性遺傳病，白化個體并不攜帶野生型TYR等位基因，白化個體間交配繁殖只能生出白化個體，育種相對方便。白化突變動物通常在野生自然環境下會因長期受到太陽紫外線照射引起損傷或癌變，而容易被自然選擇淘汰。為了驗證TYR基因敲除白化西藏小型豬是否適合培育成實驗用小型豬新品系，我們對其一些常用指標進行了檢測。目前已通過TYR敲除的F0代間交配繁殖目前已獲得了F1代、F2代、F3代TYR基因敲除白化西藏小型豬。

白化西藏小型豬與普通西藏小型豬的各體尺指標之間無明顯差異，表明了白化西藏小型豬與同齡的普通西藏小型豬的體型相近，二者的生長發育速度保持一致。同時也表明了白化西藏小型豬在普通飼養環境能正常生長發育。通過分析和比較白化西藏小型豬與普通西藏小型豬的繁殖性能指標，發現它們的繁殖性能相似，說明白化小型豬在普通飼養環境下能正常繁殖，不受TYR基因失活的影響。

初步統計，發現白化西藏小型豬的血液生理指標與普通西藏小型豬的血液生理指標絕大部分無統計學差異。不過白化西藏小型豬的MCHC略高于普通西藏小型豬的MCHC。但由于動物的血液生理學指標也會因年齡、性別、營養狀況、生理狀態等而有所差異的。總體來說，白化西藏小型豬的血液生理指標與普通西藏小型豬的血液生理指標基本一致。

實驗結果表明，TYR基因功能失活的白化西藏小型豬，除了皮毛和眼睛顏色與普通正常西藏小型豬不一樣外，各項體尺指標、繁殖性能指標、血液生理和生化指標等與普通西藏小型豬的對應指標基本保持一致。TYR基因敲除白化西藏小型豬能在普通級動物飼養環境下很好地存活和繁殖。白化西藏小型豬由于皮膚和毛發白色，更利于耳緣靜脈給藥和皮膚實驗的觀察。此外也可作為白化病大動物模型進一步研究。我們認為TYR基因敲除白化西藏小型豬適合用作實驗小型豬新品系，滿足科研實驗需求。

酪氨酸酶基因敲除白化西藏小型豬是通過CRISPR/Cas9基因編輯技術敲除TYR基因而獲得的，沒有插入任何外源基因，為非轉基因動物。獲得的白化西藏小型豬由于是通過受精卵胞質注射法而制備的，不攜帶異種品系豬的線粒體DNA——母系遺傳物質，能保持品系的純正。所用的受精卵均通過手術體內沖卵獲得，沒有到屠宰場采集卵巢和卵母細胞，生物安全可控。TYR突變引起的白化為隱性性狀，可通過白化藏豬之間交配繁殖保種，得到的后代均為白化，能穩定遺傳。白化藏豬在普通實驗飼養環境能正常繁殖存活，但在野外環境會受到長時間太陽紫外線照射而引起皮膚損傷，且沒有原有保護色容易被天敵發現和捕殺，野生條件下不易存活，生物安全性高。

4.1 評價與驗證方法

4.1.1 TYR基因突變檢測

采用聚合酶鏈反應（PCR）和DNA桑格測序（DNA sanger sequence）方法對西藏小型豬的基因型進行鑒定。一般從豬耳朵上剪取小量的皮膚組織提取DNA。若要進一步鑒定嵌合體，要從不同部分剪取組織提取DNA進行鑒定。已達性成熟的公豬可采集少量的精液提取精子總DNA來鑒定靶點基因是否存在生殖遺傳突變。用TYR基因特異性引物（表16），按表17的反應體系和表18的反應條件進行PCR。首先用桑格測序檢測PCR產物是否存在套峰，然后根據測序結果進一步做TA克隆鑒定。

表16 靶基因引物

Table 16Primers for target gene

表17 PCR反應體系

Table 17 PCR reaction system

 

表18 PCR反應條件

Table 18 PCR reaction conditions

4.1.2 脫靶檢測

利用CRISPR在線設計工具（http://crisper.tefor.net/）分析并預測可能潛在的脫靶位點。針對每條sgRNA分別各選擇10個潛在的脫靶位點（附表1）。附表1中還列出了檢測潛在脫靶位點所需要的引物。對選擇的潛在脫靶位點分別都進行PCR擴增。PCR反應體系參照表17，反應條件參考表18，但把退火溫度設為60℃。所有擴增產物的長度約600 bp。并對PCR產物進行測序，以確定是否存在脫靶。

4.1.3 石蠟切片制備

組織包埋后做成石蠟切片，可進一步用于作各種常見的病理檢查，如蘇木精伊紅染色、銀氨染色、免疫組化等。石蠟切片制備步驟主要如下：

（1）樣本固定：樣本大小應以0.5 cm×0.5 cm比較合適，浸泡于10 mL的4%多聚甲醛溶液中室溫固定。若要做免疫組化，則4℃保存。樣本最好充分浸泡一周后才做下一步實驗。

（2）梯度脫水：將固定好的樣品依次放入50%乙醇中浸泡6-8 h，75%乙醇中浸泡6-8 h，85%乙醇中浸泡3-5 h，第一缸95%乙醇中浸泡1-2 h，第二缸95%乙醇中浸泡1-2 h，第一缸100%乙醇中浸泡1 h，第二缸100%乙醇中浸泡1 h。

（3）透明：將脫水好的樣品依次放入1/2乙醇+1/2二甲苯的溶液浸泡1 h，第一缸二甲苯的溶液浸泡1 h，第二缸二甲苯的溶液浸泡1 h。注意：透明時間長短需要根據不同組織進行調整，透明過度的話，組織會變得過脆。

（4）浸蠟：將透明好的樣品依次放入1/2二甲苯+1/2石蠟中浸泡1.5 h，第一缸石蠟中浸泡2 h，第二缸石蠟中浸泡2 h。注意：應提前熔蠟，且全程不應超過65℃。新蠟最好反復煮熔，去除氣泡，變成老蠟。

（5）包埋：將組織放入模具中，把組織中將來需要切割的面朝下，于包埋機中包埋并冷卻。

（6）切片：將包好的蠟塊至于切片機上進行修整，并切出需要的切面，做成切片。切片于65℃度烤片3 h以上固定。做好的白切片可一步做染色或免疫組化等。

4.1.4 銀氨核固紅染色

銀氨核固紅染色目的是檢測和觀察組織中黑色素有無表達和分布。主要步驟有：

（1）脫蠟：將烤好的切片依次在第一缸二甲苯溶液中浸泡5 min，第二缸二甲苯溶液中浸泡5 min，95%乙醇中浸泡3 min，80%乙醇中浸泡3 min，然后蒸餾水中沖洗3 min，浸泡于蒸餾水中備用。

（2）將切片置于氫氧化物銀氨溶液中，在常溫的暗室中放置18 h。

（3）隨后取出并在蒸餾水中快速清洗切片。

（4）置于0.2%氯化金溶液染料中浸泡2 min。

（5）取出在蒸餾水中快速沖洗。

（6）將切片浸泡在5%硫代硫酸鈉溶液中3 min。

（7）取出切片，用自來水沖洗10 min。

（8）置入核固紅染液中5 min。

（9）自來水沖洗30 s。

（10）脫水、透明、封片：將染色好的切片依次放入第一缸95%乙醇中2 min，第二缸95%乙醇中2 min，第一缸無水乙醇中2 min，第二缸無水乙醇中2 min，第一缸二甲苯中2 min，第二缸二甲苯中2 min。最后用中性樹脂封片。

4.1.5 血樣本采集

采用前腔靜脈采血法，每頭豬分別采取6 mL靜脈血。其中1 mL血置于EDTA抗凝管，搖勻抗凝后，直接用于血液生理檢測。剩余5 mL加入無添加抗凝劑的普通采血管中，室溫靜置40 min，然后置于4℃離心機，3000 rpm離心30 min。吸取上層血清至新的離心管中，用于血液生化指標的測定。

4.1.6 測定體尺指標

測量7月齡白化西藏小型豬和普通西藏小型豬的體重、體長、身高、胸圍、管圍等5項指標。

4.1.7 統計繁殖性能

記錄初產和經產母豬的每窩初生仔數、斷奶活仔數，計算初生活仔率、斷奶活仔率 ADDINNE.Ref.{44AD6311-7ADA-4286-B1C6-BE142C9DECA9}。

4.1.8 測定血液生理學指標

測定白細胞總數（WBC，×109/L）、紅細胞總數（RBC，×1012/L）、血紅蛋白（HGB，g/L）、紅細胞比積（HCT，%）、平均紅細胞體積（MCV，fL）、平均紅細胞血紅蛋白（MCH，pg）、平均紅細胞血紅蛋白濃度（MCHC，g/L）、血小板總數（PLT，×109/L）、紅細胞分布寬度標準差（RDW-SD，fL）、紅細胞分布寬度變異系數（RDW-CV，%）、中性粒細胞計數（NEUT#，×109/L）、淋巴細胞計數（LYMPH#，×109/L）、中間細胞計數（MONO#，×109/L）、嗜酸性粒細胞計數（EO#，×109/L）、嗜堿性粒細胞計數（BASO#，×109/L）、中性粒細胞%（NEUT%，%）、淋巴細胞%（LYMPH%，%）、中間細胞%（MONO%，%）、嗜酸性粒細胞%（EO%，%）、嗜堿性粒細胞%（BASO%，%）等20項。

4.1.9 測定血液生化指標

丙氨酸轉氨酶（ALT，U/L）、谷草轉氨酶（AST，U/L）、總蛋白（TP，g/L）、白蛋白（ALB，g/L）、堿性磷酸酶（AKP，U/L）、血糖（GLU，mmol/L）、血尿素氮（BUN，mmol/L）、肌酐（CREA，μmol/L）、鈣（Ca，mmol/L）、磷（PHOS，mmol/L）、總膽固醇（CHOL，mmol/L）、甘油三酯（TG，mmol/L）共12項。各項指標檢測方法見表19。

表19 血生化檢測試劑及方法

Table19 Blood biochemical reagents andmethods

4.1.10 統計學方法

用檢測所得數據在IBM SPSS 20.0對各項指標進行統計學分析，每個數據以平均數±標準差（`x±s ）表示，不同處理因素間進行獨立樣本t檢驗。P值小于0.05為有顯著性差異。

4.2 結果4.2.1 F0代西藏小型豬的基因型分析及脫靶檢測

本研究對所有F0代仔豬的DNA樣本進行桑格測序和TA克隆基因型分析。結果表明大多數目的基因位點都存在有不同長度的堿基刪除、插入或堿基替換（表20）。這些位點序列改變后通常導致移碼突變使基因轉錄提前終止，或影響所表達的蛋白的結構和功能，從而導致TYR基因功能障礙，黑色素合成受阻。針對每條sgRNA選擇各了十個潛在的可能脫靶位點（附表1），并利用附表1中所列的引物，對潛在的可能脫靶位點進行PCR擴增并測序。檢測并未發現脫靶。

表20 F0代仔豬的TYR基因型

Table20 TYR genotype of F0 generation piglets

 

注：下劃線標記靶向位點。紅色文本表示堿基插入；黃色突出顯示表示堿基突變；（WT）野生型序列；（-）表示堿基刪除；（+）表示插入堿基的數目；（△）表示刪除堿基的數目；（→）表示突變堿基。

Note: Underlines marktarget sites. Red text indicates base insertion; yellow highlighting indicatesbase mutation; (-) indicates base deletion; (+) denotes the number of insertedbases; (△) denotes the number of deleted bases; (→) represents the mutant base.

4.2.2 酪氨酸酶基因敲除白化西藏小型豬的表型分析

通過觀察F0代仔豬的皮膚和頭發的顏色，能很好地判斷它們的TYR基因是否被完全敲除。其中有些F0代仔豬呈野生型黑色表型，提示至少攜帶了一個未被敲除的野生型TYR等位基因（圖5，A中的仔豬a1；圖5，C中的仔豬c10）；有些F0代仔豬呈部分色素缺失，被毛黑白相間，提示TYR基因不完全敲除，為嵌合體（圖5，C中的仔豬c11；圖5，D中的仔豬d13）；有些F0代仔豬呈完全白化表型，提示TYR基因被完全敲除（圖5，A-D中的仔豬a2、a3、a4、b5、b6、b7、b8、c9、c12、d14、d15、d16）。F0代仔豬的所觀察到的被毛顏色表型與其對應的TYR基因型是相符的（表4-11）。

TYR-KO西藏小型豬在普通實驗飼養環境下健康成長，除顏色不一樣外，體型和外貌與WT西藏小型豬幾乎一樣（圖6，A）。從肉眼來看，WT西藏小型豬的眼睛呈黑色，皮膚和被毛也為黑色；而TYR-KO西藏小型豬呈完全白化表型，眼睛呈紅色，皮膚和被毛均為白色（圖6，B）。與野生型相比，TYR-KO西藏小型豬的耳緣靜脈更加清晰（圖6，B）。從病理切片來看，WT西藏小型豬的眼睛鞏膜和睫狀肌均有黑色素分布，而TYR-KO西藏小型豬的虹膜和睫狀肌均無黑色素分布（圖7）；WT西藏小型豬的皮膚真皮層和毛囊均有黑色素分布，而TYR-KO西藏小型豬皮膚真皮層和毛囊均無黑色素表達（圖8）。

圖6 TYR-KO西藏小型豬與野生型西藏小型豬

（A）成年的TYR-KO西藏小型豬和成年的野生型藏豬；（B）TYR-KO西藏小型豬和野生型藏豬間眼睛和耳朵外觀的比較。

Figure6 TYR-KO Tibet minipigsand wild type Tibet minipigs

(A) Adult TYR-KO Tibet minipigand adult wild type Tibet minipig; (B) Comparison of eye and ear between TYR-KO Tibet minipig and wild type Tibet minipig.

圖7 TYR-KO西藏小型豬與野生型西藏小型豬的眼球病理

切片采用了銀氨核固紅染色。低倍圖像和高倍圖像的標尺分別為100μm和50 μm。

Figure7 Eyeball pathology of TYR-KO Tibet minipigs andwild type Tibet minipigs

Sections were stained with ammoniacal silver-nuclear fastred. Scale bars of low and high magnification images are 100 μm and 50 μm,respectively.

圖8 TYR-KO西藏小型豬與野生型西藏小型豬的皮膚病理

切片采用了銀氨核固紅染色。低倍圖像和高倍圖像的標尺分別為200μm和100 μm。

Figure8 Skin pathology of TYR-KO Tibet minipigs andwild type Tibet minipigs

Sections were stainedwith ammoniacal silver-nuclear fast red. Scale bars of low and highmagnification images are 200 μm and 100 μm, respectively.

4.2.3 白化西藏小型豬的繁殖育種

通過FO代TYR基因敲除白化西藏小型豬間繁殖，得到了F1代、F2代、F3代白化西藏小型豬。TYR突變白化為常染色體隱性遺傳，因此白化西藏小型豬之間進行繁殖，得到的所有子代均呈白化表型（圖9）。

圖9 繁殖所得的子代白化西藏小型豬

Figure 9Offspring albino Tibet minipigs

4.2.4 白化西藏小型豬體尺指標測定

我們對白化豬進行了繁育，并對后代白化豬進行了檢測。由表21可得，7月齡的白化西藏小型豬的體尺指標，包括體重、體長、身高、胸圍和管圍，與同齡的普通西藏小型豬之間無統計學差異（P >0.05）。白化西藏小型豬與普通西藏小型豬的各項體尺指標的均值基本相似。

表21 白化西藏小型豬與普通西藏小型豬之間的體尺指標比較（`x±s，n=8 ）

Table 21 Comparison of body size measurements betweenalbino Tibet minipigs and wild type Tibet minipigs (`x±s, n=8 )

注：白化西藏小型豬均為7月齡，雌雄各半；普通西藏小型豬均為7月齡，雌雄各半。 * 表示P值小于0.05， ** 表示P值小于0.01。

Note: The albino Tibet minipigs wereall 7 months old, half male and half female. Wild type Tibet minipigs are all 7months old, half male and half female. * means P ＜0.05, and ** means P ＜0.01.

4.2.5 白化西藏小型母豬繁殖性能測定

經統計，初產的白化西藏小型豬與初產的普通西藏小型豬之間的各項繁殖性能指標無統計學差異（表22），及經產的白化西藏小型豬與經產的普通西藏小型豬之間的各項繁殖機能指標也無統計學差異（表23）。白化西藏小型豬第一胎初生仔數約為5.75頭，經產白化西藏小型豬的產仔數增多。

表22 初產白化西藏小型豬與普通西藏小型豬之間的繁殖性能指標比較（`x±s ）

Table 22 Comparison of reproductiveperformance between primiparous albino Tibet minipigs and primiparous wild typeTibet minipigs (`x±s )

注： * 表示P值小于0.05， ** 表示P值小于0.01。

Note: * means P ＜0.05, and ** means P ＜0.01.

表23 經產白化西藏小型豬與普通西藏小型豬之間的繁殖性能指標比較（`x±s ）

Table 23 Comparison of reproductiveperformance between multiparous albino Tibet minipigs and multiparous wild typeTibet minipigs (`x±s )

注： * 表示P值小于0.05， ** 表示P值小于0.01。

Note: * means P ＜0.05, and ** means P ＜0.01.

4.2.6 白化西藏小型豬血液生理指標測定

白化西藏小型豬和普通西藏小型豬的血液生理指標的測定值經統計（表24），發現大部分血液生理指標無統計學差異（P >0.05）。除了平均紅細胞血紅蛋白濃度指標（MCHC）有統計學差異（P <0.05），白化西藏小型豬的MCHC略高于普通西藏小型豬的MCHC。

表24 白化西藏小型豬與普通西藏小型豬之間的血液生理指標比較（`x±s，n=12 ）

Table 24Comparison of blood physiological indexes between albino Tibet minipigsand wild type Tibet minipigs (`x±s, n=12 )

注：白化西藏小型豬均達12月齡，雌雄各半；普通西藏小型豬均達12月齡，雌雄各半。 * 表示P值小于0.05， ** 表示P值小于0.01。

Note: AlbinoTibet minipigs were all 12 months old, half male and half female. WT Tibetminipigs are all 12 months old, half male and half female. * means P ＜0.05, and ** means P ＜0.01.

4.2.7 白化西藏小型豬血液生化指標測定

白化西藏小型豬和普通西藏小型豬的血液生化指標的測定值經統計（表25），大部分血液生化指標無統計學差異（P >0.05）。除了丙氨酸轉氨酶（ALT）和總蛋白（TP）有統計學差異（P <0.01），白化西藏小型豬的ALT和TP較普通西藏小型豬的測定值低。

表25 白化西藏小型豬與普通西藏小型豬之間的血液生化指標比較（`x±s，n=12 ）

Table 25 Comparison of blood biochemical indexesbetween albino Tibet minipigs and wild type Tibet minipigs (`x±s, n=12 )

注：白化西藏小型豬均達12月齡，雌雄各半；普通西藏小型豬均達12月齡，雌雄各半。 * 表示P值小于0.05， ** 表示P值小于0.01。

Note: Albino Tibet minipigswere all 12 months old, half male and half female. Wild type Tibet minipigs areall 12 months old, half male and half female. * means P ＜0.05, and ** means P ＜0.01.

4.3 評價指標體系

3.1 實驗材料

3.1.1 實驗動物

動物品系：西藏小型豬；

等級：普通級；

動物規格：230-250日齡，雌性，45頭；340-360日齡，雌性，9頭；340-360日齡，雄性，2頭；

出售單位：南方醫科大學；

實驗單位：南方醫科大學；

倫理審查號：L2016088；

合格證編號：44002100009463；44002100009464；44002100009465；

實驗單位使用許可證編號：SYXK（粵）2011-0074；

許可證號：SCXK（粵）2011-0015。

本研究所用的西藏小型豬均在南方醫科大學實驗動物中心飼養。所有動物實驗都經南方醫科大學實驗動物福利與倫理委員會（IACUC）批準。所有手術均在麻醉下進行，并盡可能減少動物的痛苦。

3.1.2 試劑耗材

麥管（0.25 mL，法國，IMV）；

載玻片（7101，國產，帆船牌）；

PZM-3培養液（需配制，表1）；

TCM-199操作液（需配制，表2）；

胚胎水 (W1503，美國，Sigma)；

礦物油（M8410，美國，Sigma）；

Premix Taq（R004A，日本，Takara）；

pMD19-T Vector Cloning Kit（6013，日本，Takara）；

TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit（9762，日本，Takara）；Age I限制性內切酶（R3552，美國，New England Biolabs）；

Bsa I限制性內切酶（R3535，美國，New England Biolabs）；

Phusion 超保真 DNA 聚合酶（M0530，美國，New England Biolabs）；MEGAshortscript T7 kit（AM1354，美國，Life Technologies）；

mMESSAGE mMACHINE T7 ultra kit（AM1345，美國，Life Technologies）；

Cas9表達載體pST1374-NLS-flag-linker-Cas9 （44758，美國，Addgene）；

sgRNA克隆載體pGL3-U6-gRNA-PGK-puromycin（51133，美國，Addgene）；

RNA抽提試劑（酚:氯仿:異戊醇=25:24:1，pH<5.0）（P1011，中國，北京索萊寶科技有限公司）；

DNA抽提試劑（酚:氯仿:異戊醇=25:24:1，pH>7.8）（P1012，國產，北京索萊寶科技有限公司）

質粒小提試劑盒（DP103，中國，天根生化科技有限公司）；

血液/組織/細胞基因組提取試劑盒（DP304，中國，天根生化科技有限公司）；

四烯雌酮（CAS 850-52-2，國產，北京市科益豐生物技術發展有限公司）

1%結晶紫水溶液（G1059，國產，北京索萊寶科技有限公司）

甲醇（分析純，國產，天津市大茂化學試劑廠）

Dubecco's磷酸緩沖液（P1002，國產，北京索萊寶科技有限公司）

青霉素鉀（國產，成都中牧生物藥業有限公司）

硫酸鏈霉素（國產，華北制藥集團動物保健品有限責任公司）

手術切口無菌膜（海殼生，國產，上海海純生物有限公司）

可吸收線（金環，國產，上海浦東金環醫療用品股份有限公司）

常用手術器械（金鐘，國產，上海醫療器械有限公司手術器械廠）

寵物用留置針（海迪科，國產，山東海迪科醫用制品有限公司）

毛細玻璃管（規格1.0×0.6×100 mm，國產，北京正天易科貿有限公司）

保溫瓶（SSAM-B1500，國產，上海萬盛保溫容器有限公司）

常用手術耗材（國產，紗布、棉簽、棉球、碘酊、刀片等）

不同規格的培養皿、離心管、EP管、吸頭等（美國，Corning）

血液生理分析試劑（日本，Sysmex廠家配套試劑）

血生化檢測試劑（見表19，國產，北京九強生物技術有限公司）

3.1.3 儀器設備

高速冷凍離心機（3K18，美國，Sigma）

PCR擴增儀（PTC 200，美國，Bio-Rad）

凝膠成像系統（GelDoc EQ，美國，Bio-Rad）

超低溫冰箱（-80℃）（702，美國，Thermo）

紫外分光光度計（NanoDrop 2000，美國，Thermo）

高速離心機（Centrifuge 5418，德國，Eppendorf）

核酸蛋白測定儀（Biophotometer 6131，德國，Eppendorf）

電泳儀（DYY-2C，國產，北京市六一儀器廠）

紫外透射儀（GL-312，國產，江蘇海門市麒麟醫用儀器廠）

電子分析天平（BT224S，國產，賽利多斯科學儀器有限公司）

生化培養箱（SPX-250B，國產，上海福瑪實驗設備有限公司）

電熱恒溫水浴鍋（HWS12，國產，上海一恒科學儀器有限公司）

細菌恒溫搖床（SPH-210A，國產，上海雙旭電子有限公司）

潔凈工作臺（SW-OJ-2FD，國產，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司）

生物安全臺（HFsafe-1800，國產，上海力申科學儀器有限公司）

高壓蒸汽消毒器（HVE-50，日本，HIRAYAMA Manufacturing Corporation）

金屬浴（TOMCS BG25，國產，杭州朗基科學儀器有限公司）

恒溫熱臺（TP-CK05，日本，TOKAT HIT）

拉針儀（P-97，美國，SUTTER INSTRUMENT Company）

煅針儀（MF-900，日本，NARISHIGE Company）

體視顯微鏡（SZX10，日本，OLYMPUS）

顯微注射顯微鏡（CKX41SF，日本，OLYMPUS）

顯微操作儀（TransferMan NK2，德國，Eppendorf）

移液槍（各量程，德國，Eppendorf）

血液分析儀（XT-1800i，日本，Sysmex Corporation）

熒光顯微鏡（BX43，日本，OLYMPUS）

包埋機（EG1160，德國，Leica）

切片機（RM2245，德國，Leica）

烘片機（HI1220，德國，Leica）

攤片機（HI1210，德國，Leica）

3.1.4 軟件系統

SPSS統計分析軟件（IBM SPSS 20.0）

Toup View軟件系統（國產，北京拓普視野科技有限公司）

3.1.5 試劑配制

（1）PZM-3培養液配制：

表1 PZM-3胚胎培養液

Table 1 PZM-3 Culture medium

（2）TCM-199操作液配制：

表2 TCM-199操作液

Table 2TCM-199 Manipulation medium

3.2 實驗方法

3.2.1 設計和構建CRISPR/Cas9系統

（1）首先通過Ensembl genome browser數據庫了解豬的TYR基因的基因序列（尤其是外顯子序列及編碼區）及蛋白結構功能，選擇合適的敲除基因位點。注意：不同豬種間的基因序列可能突變差異，應以本實驗西藏小型豬的測序結果為準，不應完全按照網上數據庫。

（2）通過在線網站（http://crispor.tefor.net/）針對西藏小型豬的TYR基因序列設計sgRNA。

（3）根據設計的sgRNA序列，設計出反向互補的雙鏈，并在雙鏈上分別添加與sgRNA空載連接的接頭，則需成在上鏈的5’端前面添加CCGG，需在下鏈的5’端前面添加AAAC，合成帶接頭的oligos（表3）。

表3 oligos序列

Table 3 Oligossequence

（4）將oligos磷酸化，然后退火形成帶粘性末端的短片段雙鏈DNA。反應體系見表4，反應條件為：先在37℃中反應30 min，然后置于裝有1 L開水的燒杯中煮沸5 min，最后待燒杯中的水自然冷卻至常溫后取出反應物。

表4 PNK退火反應體系

Table 4-2PNK annealing reaction system

（5）酶切sgRNA克隆載體pGL3-U6-gRNA-PGK-puromycin，酶切反應體系按表5，反應條件為37℃孵育過夜。

表5 酶切反應體系

Table 5Enzymatic reaction system

（6）將步驟5中得到的酶切產物，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，然后采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒切膠回收長片段DNA。

（7）連接構建sgRNA表達載體，反應體系按表6，反應條件為16℃孵育30-60 min。

表6 連接反應體系

Table 6Connection reaction system

（8）將步驟7的產物直接用于質粒轉化。然后挑取單克隆，送菌液或質粒測序（測序引物為U6通用引物，正向測序），根據測序結果選取構建正確的sgRNA質粒。

3.2.2 sgRNA的制備

3.2.2.1 sgRNA的體外轉錄模板制備

用高保真DNA聚合酶對sgRNA質粒進行PCR擴增。PCR引物按表8，反應體系按照表9，反應條件如表10。得到帶T7啟動子的sgRNA體外轉錄模板后，進行2%瓊脂糖膠TBE電泳，判斷條帶大小是否符合預期：sgRNA體外轉錄模板大小為約120 bp。獲得后的體外轉錄模板采用苯酚/氯仿/異戊醇進行抽提，乙醇和乙酸鈉沉淀純化。

表8 引物序列

Table 8Primer sequence

表9 PCR反應體系

Table 9PCR reaction system

注：需要制備6管PCR產物，因為PCR產物達300 μL以上便于進行DNA純化。

Note:Six tubes of PCR products need to be prepared, because the PCR products aremore than 300 μL, which is convenient for DNA purification.

表10 PCR反應條件

Table 10 PCR reaction conditions

3.2.2.2 sgRNA的體外轉錄和純化

將已純化的sgRNA體外轉錄模板用T7體外轉錄試劑盒（MEGAshortscript T7 kit）進行體外轉錄。合成的sgRNA經核酸純化后才能用于顯微注射。

（1）首先進行體外轉錄反應合成sgRNA，反應體系按表11，反應條件為37℃，4 h。

表11 體外轉錄反應

Table 11 In vitro transcription response system

注：T7 Reaction Buffer需恢復至常溫才可加入到體系中，否則低溫條件下其成分可引起DNA模板產生沉淀。

Note:T7 reaction buffer can be added to the system only after it is restored tonormal temperature, otherwise, its components can cause DNA template toprecipitate under low temperature.

（1）然后去除DNA模板：加入1 μL TURBO DNase，反應條件為37℃，15 min。

（2）最終獲得的sgRNA用苯酚/氯仿/異戊醇進行抽提，乙醇和乙酸鈉沉淀純化。

3.2.3 Cas9 mRNA的制備

3.2.3.1線性化質粒pST1374-NLS-flag-linker-Cas9

酶切酶切反應體系見表12，反應條件：37℃溫浴，酶切消化過夜。

表12 酶切反應體系

Table 12 Enzymatic reaction system

注：要消化至少30 μg的質粒才利于下一步做體外轉錄模板的純化。酶切產物需取少量進行瓊脂糖電泳鑒定，確保酶切完全，所有質粒被線性化。

Note: It is necessary to digest at least 30 μg of plasmids forfurther purification of in vitro transcription template. A small amount ofenzyme products need to be identified by agarose electrophoresis to ensurecomplete enzyme digestion and all plasmids are linearized.

3.2.3.2Cas9體外轉錄模板的純化

質粒pST1374-NLS-flag-linker-Cas9被完全線性化后，為了去除RNA酶和其他雜質，采用苯酚/氯仿/異戊醇進行抽提，乙醇和乙酸鈉沉淀，純化后作為體外轉錄模板。

3.2.3.3體外轉錄Cas9 mRNA

將純化后的Cas9體外轉錄模板用T7啟動子體外轉錄試劑盒（mMESSAGE mMACHINE T7 ultra kit）進行體外轉錄。合成顯微注射用的Cas9 mRNA需要分3步：

（1）首先進行體外轉錄反應，形成初步的mRNA，反應體系參照表13，反應條件為37℃，2 h。

表13 體外轉錄反應

Table 13 In vitro transcription response system

注意：T7 Reaction Buffer需恢復至常溫才可加入到體系中，否則低溫條件下其成分可引起DNA模板產生沉淀。

Note:T7 reaction buffer can be added to the system only after it is restored tonormal temperature, otherwise, its components can cause DNA template toprecipitate under low temperature.

（1）去除DNA模板：加入1 μL的TURBODNase，反應條件為37℃，15min。

（2）對mRNA加入polyA序列，使mRNA更穩定性，反應體系參照表14，反應條件為37℃，30-45min。

表14 加polyA反應體系

Table 14 Add polyA reaction system

注意：反應完成后應立刻進行Cas9 mRNA純化，防止RNA降解。

Note: Cas9 mRNA should be purified immediately after thereaction to prevent RNA degradation.

3.2.3.4Cas9 mRNA的純化

為了去除RNA酶和其他雜質，先用苯酚/氯仿/異戊醇抽提RNA，再用乙酸鈉和乙醇沉淀RNA。全程要注意采用無RNA酶的槍頭和手套。最后要加入適量的胚胎水溶解Cas9 mRNA，并分裝于無RNA酶的PCR管中（4 μL/管），-80℃冰箱保存。Cas9 mRNA要保證濃度大于500 ng/μL。

3.2.4 同步發情

選擇4-7頭健康的性成熟雌性西藏小型豬（7月齡以上）作為供卵母豬，進行同步發情處理。每頭母豬每日早上8點喂服20 mg四烯雌酮口服乳濁液，一日一次，持續服用18天。停藥后第4天始，每天早晚各觀察發情一次，大部分母豬會在停藥后5-8天內出現發情。

3.2.5 發情配種

母豬在停止喂服四烯雌酮后第5天左右開始有發情跡象，陰道變紅變腫。這時每天用公豬試情1-2次，誘導母豬發情更加同步。在上午清潔欄舍前或下午四點左右觀察發情。西藏小型豬在發情早期會爬跨其他母豬，圈舍地面較平時臟亂。當西藏小型豬處于發情中期時遇公豬會靜立不動，此時人用手按壓其背部，母豬也靜立不動。當母豬進入發情后期，陰道紅腫會消退，拒絕公豬交配。西藏小型豬單籠飼養時不易觀察發情，但母豬發情時會表現進食減少、煩躁不安。

通過陰道細胞涂片結晶紫染色法來判斷母豬是否已達到最佳發情狀態。首先將棉簽輕輕地插入母豬陰道并旋轉數圈。抽出棉簽，將陰道物均勻涂布在載玻片上，并自然晾干（棉簽在玻片上應朝一個方向滾動涂布，不可重復涂布，避免細胞重疊影響觀察）。然后載玻片用甲醇脫水30 s，并自然晾干。接著結晶紫溶液染色1 min。最后用清水沖洗3次，并再次晾干，顯微鏡下觀察。在普通光學顯微鏡下觀察涂片上的表皮細胞的大小、形態及比例等來判斷西藏小型豬的發情階段。當鏡下觀察到大部分細胞為邊緣皺褶、體積較大且無細胞核的完全角質化鱗狀上皮細胞時，母豬處于最佳發情狀態。當母豬表現為靜立發情，且陰道細胞涂片提示處于最佳發情階段時，進行配種。采用自然交配方式或人工授精方式進行配種。

3.2.6 體內沖卵

供卵母豬在配種后16-18 h要進行取卵手術，收集單細胞期受精卵。具體步驟如下：（1）術前母豬禁食12 h；（2）靜脈注射戊巴比妥鈉溶液（用量為30-45 mg/kg）進行麻醉；（3）下腹部剃毛備皮、清洗、手術消毒；（4）在下腹鼠蹊部肌間隙處開出4-6 cm手術切口；（5）將食指和中指從術口探入腹腔內，憑手指觸覺分辨出子宮角（相對于腸而言，子宮角壁較厚一些），用雙指輕輕將其夾出，將卵巢和輸卵管暴露在手術視野中；（6）將無菌塑料導管的一端從輸卵管傘部天然開口處插入，另一端置至塑料平皿上；（7）在輸卵管子宮角交接處靠近輸卵端輕輕插入一根留置針。同時用手捏緊靠近子宮角的輸卵管，防止沖卵時液體進入子宮；（8）用注射器將含0.1%牛血清白蛋白的杜氏磷酸鹽緩沖溶液從留置針處推入，液體和胚胎經輸卵管從傘部開口沿塑料導管被沖入塑料平皿中；（9）在視顯微鏡下用口吸管撿卵，將卵移至操作液滴中。注意：顯微鏡應帶恒溫熱臺，保持38.5℃。

3.2.7 胚胎運輸

豬胚胎應在38.5℃保持活力，當豬卵暴露在低溫環境中時極易死亡，采集到的胚胎必須嚴格恒溫運輸。采用簡易裝置進行短途運輸 ADDINNE.Ref.{77F6BCEF-A63D-4062-9063-977DEDBF0A73}[12]，步驟如下：（1）先用無菌麥管依次吸入：約1 cm的TCM-199操作液液段，約1 cm的空氣段，約1.5 cm含有胚胎的TCM-199操作液液段，約1 cm的空氣段，約1 cm的TCM-199操作液液段；（2）將麥管兩端用燒熱的鉗子封管；（3）將麥管一端固定在泡沫浮標中；（4）再將麥管和浮標裝入有38.5℃溫水的真空保溫瓶中，并盡快送回實驗室。

3.2.8 胚胎培養

顯微注射前應將胚胎放入PZM-3培養基液滴中，在含5% CO2的38.5℃培養箱培養半小時以上。注意：PZM-3液滴需要在取卵前一天晚上做好，放入CO2培養箱中平衡12 h才能使用。顯微注射操作時，將胚胎移至于含TCM-199的操作液中。

3.2.9 顯微注射

配制顯微注射的RNA溶液中，Cas9 mRNA的終濃度是100 ng/μL，每種sgRNA的終濃度均為50 ng/μL。在受精卵處于單細胞期或二細胞期時進行胞質內注射。二細胞期注射時，對卵中的每個細胞分別進行注射。本研究采用的是TransferMan NK2顯微注射操作系統。完成顯微注射后，將胚胎移至平衡好的PZM-3培育基中，于含5% CO2的38.5℃培養箱中培養1 h，再進行胚胎移植。

3.2.10 胚胎移植

西藏小型豬胚胎移植通過手術進行。一般每頭代孕母豬移植10～15枚受精卵。對處于發情期的代孕母豬進行麻醉后，剃毛、備皮、消毒、鋪巾。在下腹鼠蹊部開一小口，露出卵巢和輸卵管。將胚胎吸至胚胎移植管，吸入的液體和空氣盡可能少。將胚胎移植管輕輕從輸卵管傘部開口插入，進至輸卵管第一個大彎曲之后。將移植管內含胚胎的液體注入輸卵管，并把移植管退出，然后將卵巢和輸卵管放回腹腔，逐層縫合傷口。胚胎移植一般只需移植一側的輸卵管即可。術后連續3天肌肉注射青霉素和鏈霉素預防感染。移植后第19～21天及第40天，用豬驗孕卡或B超儀檢測是否妊娠，妊娠過程中留意代孕母豬有無返情。

3.3 結果 利用CRISPR/Cas9受精卵胞質注射法制備基因修飾西藏小型豬的基本流程圖3所示。針對TYR基因設計了2條sgRNA（圖4）。74枚西藏小型豬受精卵經胞質內注射Cas9 mRNA和sgRNA混合物后，分別移植至7頭代孕母豬身上，其中4頭代孕母豬成功懷孕（分別稱為代孕母豬A、B、C和D，C和D除了TYR基因編輯外，同時還編輯了其他基因，因而所產的F0代不納入白化保種范圍，只能用于效率統計）。代孕母豬A、B、C、D各自產下了4頭仔豬。妊娠的代孕母豬都在114天左右自然分娩，沒有發現妊娠期延長或胎兒發育落后的現象（表15）。出生的16只F0代仔豬中，公與母的性別比為9:7，產仔數與移植胚胎數的比率在33.3%到50%之間（表15）。16只F0代仔豬中有12只（即a2、a3、a4、b5、b6、b7、b8、c9、c12、d14、d15和d16）呈完全白化表型，剩下仔豬a1和c10為黑色表型，而仔豬c11和d13為部分色素缺失表型（圖5，A-D）。

圖3 利用CRISPR/Cas9受精卵胞質注射法制備基因修飾西藏小型豬

Figure3 Generating gene-modified Tibetminipigs by CRISPR/Cas9 cytoplasmic injection

圖4 sgRNA設計位點示意圖

Figure 4 Schematic diagram of sgRNA design loci.

圖5 F0代仔豬

（A）代孕母豬A產下仔豬a1-a4；（B）代孕母豬B產下仔豬b5-b8；（C）代孕母豬C產下仔豬c9-c12；（D）代孕母豬D產下仔豬d13-d16。

Figure5 F0 generation piglets

(A) Surrogate A gave birthto piglets a1 - a4; (B) Surrogate B gave birthto piglets b5 - b8. (C) Surrogate C gave birthto piglets c9 - c12; (D) Surrogate D gave birthto piglets d13 - d16.

表15 受精卵胞質注射法制備基因修飾西藏小型豬

Table15 Generating gene-modified Tibetminipigs by cytoplasmic microinjection

注：C和D進行了雙基因編輯，經僅供計算效率，雙基因編輯藏豬不用于后期白化藏豬品系的培育。

西藏小型豬原產于我國青藏高原，是少有的高原型豬種 ADDINNE.Ref.{DFBE4C28-9248-4ECA-94AD-C01D749F38CF}[1]，能適應惡劣的高寒氣候和以放牧為主的低劣飼養條件 ADDINNE.Ref.{3FBA4E4C-2B11-4139-920A-BC0F867D6960}[2]，也是我國目前已知小型豬品種中體重最輕的品種之一。2004年顧為望教授等人從中國西藏林芝地區將藏豬引種到亞熱帶地區中國廣州，進行了風土馴化和實驗動物化研究，并正式命名為實驗用西藏小型豬 ADDINNE.Ref.{BD2173C6-8A46-4DCB-A8B4-52DF31E71172}[3]。

西藏小型豬四肢結實緊湊，蹄質堅硬，被毛多為黑色硬毛，頸部有一直延伸到肩部的鬃毛（圖1）。中國豬品種志記載，成年雌性藏豬體重30.96 kg，體長80.31 cm，體高48.81 cm，胸圍71.74 cm；成年雄性藏豬體重38.30 kg，體長82.58 cm，體高49.83 cm，胸圍77.00 cm ADDINNE.Ref.{088694DB-CBD3-4A28-AEF8-E2E11C0C99CA}[4]。研究發現藏豬中有18個與胎盤發育相關的基因和39個與子宮血液循環相關的基因得到了快速進化，使藏豬能在條件惡劣的高海拔環境下成功繁殖后代 ADDIN NE.Ref.{7EDC685C-604C-454C-B456-4247515003D7}[5]。與普通家豬相比，藏豬通過減少每胎的產仔數量（藏豬：4-8頭每胎，家豬：8-10頭每胎），優化子宮血液循環，有效增加氧的利用效率，來產出更強壯的仔豬以適應惡劣環境（仔豬與母豬的體重比例，藏豬：2.83%，家豬：0.57%） ADDIN NE.Ref.{6072F24D-8A45-498A-A5CA-8A98E904C55A}[5]。藏豬有較強的耐寒能力，與胞內線粒體產能有著密切的關系。西藏小型豬線粒體DNA序列具有一定的獨特性，其線粒體控制區的串聯重復區具有A型和B型。約有54.9％的西藏小型豬的串聯重復區序列全部為“gtacacgtgc”，稱為A型；約有45.1％的西藏小型豬的串聯重復區序列在靠近3’端為“gtacacgtgc”，而靠近5’端有較多的G→A轉換，形成“gtacacatge”和“gtacacgtac”排列或交錯排列，稱為B型。而國內其他小型豬和在基因庫查詢到的其他豬種的串聯重復區均只有A型，很少發生變異，B型未見報道 ADDINNE.Ref.{18F2AA48-B051-4B7C-9644-1342C26B743A}[6]。

實驗用西藏小型豬

西藏小型豬生長速度慢，耐粗飼，體型勻稱，抗病性和抗逆性好，手術耐受性強，是較為理想的實驗用小型豬種。但由于西藏小型豬全身被毛和皮膚均為黑色，有時會影響了某些實驗操作和觀察，如皮膚顏色太深使得耳緣靜脈不清晰，難以順利進針，不易于進行耳緣靜脈給藥。此外，也不利于對皮膚充血、淤血、出血、炎癥、紅腫、過敏等癥狀的觀察。白化品系實驗動物，如BALB/c小鼠、SD大鼠、新西蘭大白兔、白化豚鼠等，便于實驗操作和觀察，所以更容易受到研究者的喜愛，白化品系實驗動物更受研究者喜愛。但目前自然界中尚未發現天然白化的西藏小型豬品種。

動物的膚色、毛色和瞳色是由黑色素的合成和分布決定的。黑色素由黑色素細胞合成，合成后的黑色素一般會聚集形成黑素小體。黑色素有兩種，包括真黑素和褐黑素，可按一定比例混合（圖2）。混合黑色素中，真黑素比例越高，就越呈黑色；而褐黑素比例越高，就越呈紅色。酪氨酸酶基因（tyrosinase gene，TYR）所表達的酪氨酸酶是黑色素合成的關鍵酶（圖2），它的表達活性決定著黑色素合成的數量和速度 ADDINNE.Ref.{EE85DA2D-EFC8-4CC8-A8BA-877F9305887B}[7]。皮膚中的黑色素細胞主要分布于表皮基底層和毛囊。皮膚黑色素可吸收紫外輻射，防止皮膚細胞受到紫外照射損傷。眼皮膚白化病（oculocutaneous albinism，OCA）是一組遺傳性黑色素合成障礙疾病，其特征是毛發、皮膚和眼睛的色素沉著普遍減少。全世界各種形式的白化病的患病率差異很大，據估計約為1/17000 ADDINNE.Ref.{A25F422B-1149-45C0-890F-DCC1C9A5688B}[8]。OCA臨床上有不同分類，OCA1A是最嚴重的類型，完全無黑色素合成，而較輕的OCA1B、OCA2、OCA3和OCA4可有一定的色素積累。OCA1、OCA2、OCA3、OCA4分別與TYR、OCA2、TYRP1和MATP基因有關，四種OCA均為常染色體隱性遺傳病 ADDINNE.Ref.{C1481B98-DE58-4747-AB17-A8B829374EE7}[9]。其中TYR基因發生突變引起酪氨酸酶功能缺失和減弱，導致黑色素合成障礙，是造成人和其他動物白化的常見原因。OCA病人可存在眼睛發育異常，臨床表現包括不同程度的先天性眼球震顫、虹膜色素減少和半透明、視網膜色素沉著減少、中央凹發育不全、視敏度降低、屈光不正、色覺障礙和明顯的畏光。其中，中央凹發育不全和視網膜到視皮層的光感神經纖維走行異常 ADDINNE.Ref.{8492C15F-C75F-4349-AD87-26BC2293B073}[10]，可導致斜視和降低立體視覺。佩戴深色眼鏡能減輕眼畏光癥狀。不同類型OCA病人的皮膚和毛發色素沉著的程度不一樣，皮膚容易因太陽光照射而損傷。OCA患者有正常的壽命、發育、智力和生育能力。

黑色素的合成

PAH，苯丙氨酸羥化酶；TYR，酪氨酸酶；TRP，酪氨酸酶相關蛋白。黑色素有兩種，包括真黑素和褐黑素。

為了能讓西藏小型豬更易于實驗觀察和實驗操作，能得到更廣泛的應用，本單位利用CRISPR/Cas9基因編輯技術受精卵胞質內注射法定向培育了酪氨酸酶基因敲除白化西藏小型豬。白化西藏小型豬全身皮膚和被毛均呈白色，眼睛因缺乏黑色素而呈紅色，呈典型的白化表型，可作為白化病大動物模型供臨床研究。白化西藏小型豬的皮膚更加清晰，有利于對皮膚紅腫、出血、淤血、過敏、炎癥、損傷等的觀察，還便于在皮膚或被毛上作清晰的標記。經統計白化西藏小型豬的體尺指標、繁殖性能、血液生理和生化指標等與普通西藏小型豬對應指標相比，基本上無統計學顯著性差異（P >0.05），適合進一步培育成實驗小型豬新品系推廣應用。