MERS-CoV氣管鏡途徑感染恒河猴模型

1、MERS-CoV 感染恒河猴臨床觀察

MERS-CoV攻毒后，恒河猴表現了一定的感染癥狀，主要表現為攻毒后體溫出現瞬時升高，即感染后1天、2天體溫急劇上升，但3天時恢復正常（圖1）。并且恒河猴在攻毒后飲水量減少，整個實驗期內恒河猴體重并未有明顯的變化，也沒出現死亡現象。對攻毒后恒河猴進行了血常規檢測，發現攻毒后1天，白細胞有瞬時升高，但3天時就恢復正常。另外還進行了肝功能和腎功能檢測，結果發現攻毒前后并未發生改變。對照組恒河猴無任何臨床癥狀。

2、MERS-CoV感染恒河猴病理學檢查

MERS-CoV感染前和感染后3天和5天分別進行了肺部X光拍攝，感染前肺部并未觀察到任何變化，感染3天時肺右下出現陰影，表明肺部有炎癥反應。5天時陰影面積有所減小，但仍存在（圖2A）。MERS-CoV感染后3天，大體解剖可見恒河猴肺部有不同程度充血呈暗紅色，其位置跟X光檢查結果一致（圖2B）。而對照組肺部無明顯變化。顯微病理檢查可見攻毒組恒河猴出現間質性肺炎，表現為肺泡隔中度到重度增寬，以支氣管為中心發生灶狀實變，其中大量的炎性細胞浸潤，以淋巴細胞、巨噬細胞為主，少量嗜中性粒細胞和漿細胞；血管淤血，伴有出血；支氣管管腔中可見少量滲出和紅細胞，而對照組無此變化（圖3）。肺外其它組織未見明顯的病理改變。免疫組化分析表明攻毒組恒河猴肺和氣管中可檢測到病毒蛋白的表達，陽性細胞主要分布在Ⅰ型、Ⅱ型肺泡細胞和巨噬細胞。肺外器官并未檢測到病毒蛋白的存在。對照組猴肺中并未檢測到病毒特異蛋白的存在（圖4）。

3、qRT-PCR方法檢測拭子和組織樣品病毒載量

攻毒后分別對拭子樣品和組織樣品進行病毒核酸檢測，結果發現攻毒后僅在肺部和氣管檢測到高的病毒載量，特別是攻毒后1天時，咽拭子也檢測到了較高的病毒載量。而在其它組織和其它時間點拭子檢測不到病毒核酸或很低的病毒載量存在。對照組恒河猴組織和拭子樣品未檢測到病毒核酸的存在（圖5）。

4、 拭子和組織樣品中病毒滴度測定

對采集的鼻拭子、咽拭子、肛拭子在Vero細胞上進行病毒滴度測定，并未

分離到病毒，與PCR檢測檢測結果一致。攻毒后3天，采集的組織樣品也進行

病毒分離，只在肺部和氣管分離到病毒，肺部病毒滴度達101.67 TCID50/ml，氣管病毒滴度達101.5 TCID50/ml。其他器官（腎臟、大腦、心臟、肝臟、脾臟和腸）并未分離到病毒。對照組恒河猴拭子和組織樣品均未分離到病毒。

5、 MERS-CoV 感染后血清中和抗體檢測

攻毒后7天、14天、21天和28天，采集感染組和對照組恒河猴血液，分離血清進行中和抗體檢測。微量中和試驗結果顯示感染組恒河猴在攻毒后7d即可檢測到中和抗體的存在，在感染后14d時達到高峰，可達1：320，之后抗體滴度稍微有所下降，在攻毒后28d時達到1：160。對照組血清中檢測不到中和抗體的存在。

實驗用恒河猴在實驗室內傳代三次以上，遺傳背景明確，年齡為1-3歲。實驗前進行血清學檢查證明抗MERS抗體陰性。恒河猴在生物安全三級（BSL-3）實驗室內飼養，并按國家動物生物安全標準操作規程進行操作。

MERS-CoV(hCoV-EMC，GenBank: MH454272.1）由荷蘭伊拉斯姆斯大學醫學中心Ron Fouchier 教授饋贈。采用支氣管鏡輔助攻毒，攻毒劑量為6.5×107TCID50/1ml/只。

觀察攻毒后恒河猴臨床癥狀，每天兩次。分別于攻毒前1d和攻毒后3d、5d

進行肺部X光拍攝。攻毒后3天，MERS-CoV攻毒組安樂死2只恒河猴，對照組安樂死1只，采集肺、氣管、心、脾、腎、腦、肝臟、腸組織進行病理、免疫組化和病毒檢測。攻毒后分別在1, 3, 5, 7, 9, 11, 14, 21和28天采集咽拭子、鼻拭子、肛拭子進行病毒檢測。并且在攻毒后7, 14, 21和28天采集血液分離血清，進行中和抗體檢測。

2012 年6 月埃及病毒學家Zaki 從沙特一位患有急性肺炎并伴發急性腎衰竭的男性患者中分離到了一株冠狀病毒。隨后他把病毒樣本送到了荷蘭鹿特丹伊拉斯姆斯大學醫學中心（Erasmus Medical Center），Ron Fouchier 教授最終證實的確是一種以前沒有見過的冠狀病毒，命名為 HCoV-EMC，是一種不同于SARS 冠狀病毒(SARS-CoV)的新型冠狀病。

隨后英國的科學家也確認了一名來本國就醫的卡塔爾患者也感染了這種新型冠狀病毒，癥狀亦是嚴重呼吸綜合征，將該病毒命名為人冠狀病毒-England 1( human coronavirus England 1)。后續經證實兩病例感染的病毒為同一病毒，序列比對有99.5%的相似性。

2012 年9 月23 日，世界衛生組織發布公告，確認有2 名患者感染了新型冠狀病毒，兩人臨床表現為急性呼吸道感染，并伴有急性腎衰竭。此后幾個月該病毒在中東地區接連出現，并出現了小群體傳播事件。另外一些歐洲、美洲、非洲國家也出現來自中東的輸入病例，分離的毒株也越來越多，并各自命名，比如

humanbetacoronavirus 2CJordan-N3、humanbetacoronavirus 2c England-Qatar 等。為統一新型冠狀病毒名稱，方便新型冠狀病毒感染病例的通報，2013 年5月國際病毒分類委員會冠狀病毒研究小組將此新型冠狀病毒命名為中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV)。

據WHO 報道該病的潛伏期為2-15天。臨床表現以急性呼吸道感染為主要癥狀。發病快、高熱、體溫可達39-40℃，伴有畏寒、寒戰，咳嗽、胸痛、頭痛、全身肌肉關節酸痛、乏力、食欲減退等癥狀。在肺炎基礎上，臨床病變進展迅速，很快發展為呼吸衰竭、ARDS 或多器官功能衰竭（MODS），特別是腎功能衰竭，危及生命，少數病例病情相對較輕。患者還可能出現消化道癥狀，如腹瀉和胃部不適等；有些患者還會發生膿毒性休克，導致死亡。免疫力低下、老年人和伴有慢性病（如糖尿病、癌癥和慢性肺部疾病）的人群更易發展為重癥。

影像學表現：胸部X 光片的結果和局限性肺炎、ARDS 的結果一致，如雙側肺門浸潤，單側或雙側片狀增厚、分割或肺葉混濁，毛玻璃樣外觀，胸膜積液等。下部肺葉比上部肺葉受損程度更大。CT 掃描則顯示間質性浸潤和實病。患者通常表現為白細胞減少，尤其是淋巴細胞減少。另外患者的血、尿及糞便中均能檢測到病毒RNA，但遠少于呼吸道內的病毒量，且上呼吸道中的病毒量通常也比下呼吸道量少。在一些病患中發現有其它呼吸道病毒共感染，在機械通氣的病患中也出現醫院獲得性細菌感染。