結核分枝桿菌感染恒河猴模型

該模型的主要評價指標為不同感染期的肺脾肝荷菌量和病變評分值，該模型與國內外報道的經典cornell模型類似，但是cronell模型的問題在于模型潛伏期荷菌量過高，復發期3-9個月后不等。本模型不斷的摸索嘗試克服以上問題，模型均一，參數指標穩定，各感染期的荷菌量值水平合適（不過低也不過高），周期明顯縮短，由3-9個月不等的周期縮短到比較穩定的10周，便于應用。

該模型不僅可以用于潛伏及復發的早期診斷分子的研究，還可以利用潛伏及復發期研究疾病機制，同時可以用于評價潛伏感染的預防性抗生素效果，以及治療性疫苗的效果。

動物模型的制備的設計得到研究所IACUC委員會的批準，人員都是訓練有素的研究人員和實驗人員，全程在ABSL-3實驗室中進行，完全按照模型制備和檢測的一系列SOP操作進行，遵守生物安全操作要求，無安全事故。

1恒河猴感染結核菌后OT實驗

3只恒河猴感染結核分支桿菌后的第4周進行OT試驗，右側眼瞼明顯出現紅腫，存在一定程度的閉合，個體間有一定差異。舊結核菌素反應均可判斷為陽性。

2恒河猴感染結核菌前后體重的變化

3只恒河猴感染結核分支桿菌前動物的體重都呈上升趨勢。在感染結核菌之后的前兩周相比感染前體重也有上升。但是在感染結核菌后的4周和6周動物的體重均出現下降。在感染后的第9周B1和C6的體重基本穩定，C8的體重表現為上升。

3恒河猴感染結核菌前后體溫的變化

3只恒河猴感染結核分支桿菌之后的前兩周相比感染前體溫相對穩定。但是在感染結核菌后的4周體溫升高，感染后第6周動物的體溫出現一定程度的下降，但仍高于正常體溫。在感染后的第9周C6的體溫仍較高。B1和C8的體溫降至39度以下。B1和C8目前表現為一過性的低熱，C6的體溫變化仍需繼續觀測。

4恒河猴感染結核菌前后血沉變化

3只恒河猴感染結核分支桿菌之后的前兩周相比感染前血沉相對穩定。但是在感染結核菌后的4周C6的提高，感染后第6周3只猴的血沉都有一定程度的提高。在感染后的第9周B1、C6的血沉仍較高。C8的血沉降至較低水平。

5恒河猴感染結核菌前后CRP變化

3只恒河猴感染結核分支桿菌之后的前兩周相比感染前CRP相對穩定。但是在感染結核菌后的4周、6周、9周B1、C6的CRP升高。C8的CRP在感染結核后一直維持在較低水平。

6影像學檢測結果

恒河猴C6 CT胸部影像和胸部X光檢查結果顯示其右肺中下葉存在實變影，縱隔發生右向移位，心臟偏于右側，這可能是右側肺中下葉不張引起。右肺上葉和左肺多處存在片狀實變影，散點狀結節影多見。根據CT和X光檢測的結果判斷有支氣管結核和肺結核的可能。

恒河猴B1 CT胸部影像和胸部X光檢查結果顯示其右肺下葉存在片狀影，縱隔發生右向移位，心臟偏于右側，這可能是右側肺下葉不張引起。肺組織偶見散點狀結節影。

恒河猴C8 CT胸部影像和胸部X光檢查結果顯示其右肺中下葉后段存在滲出影，CT能動態監測右肺葉的病變, 如圖8。由于C8猴的病變較輕，因此在CT引導下進行組織病理活檢，確證結核感染。

7結核抗體檢測

采用臨床人類使用的結核抗體檢測的膠體金法對感染動物的血清進行了分析。在動物感染結核菌6周和9周時結核抗體陽性。下圖顯示6周時血清抗體檢測結果。而在感染結核菌2周和4周時結核抗體表現為弱陽性。值得注意的是恒河猴感染前血清檢測時也可以看到結核抗體的弱陽性。

8病理病變

大體病理：

肺組織各葉可見結核結節及滲出性病變，以右肺中下葉病變最重；肝細胞脂肪變性，肝臟內內可見多個結核結節；脾臟內可見多個結核結節；腎被膜下多灶性炎細胞浸潤，可見少數結核結節；心房多灶性炎細胞浸潤（以巨噬細胞為主）；附睪內可見結核結節；睪丸灶性壞死及炎細胞浸潤；胃粘膜炎細胞浸潤；支氣管旁淋巴結、肺門淋巴結可見巨大結核結節；大腸、小腸、腦組織、膽囊、胰腺、腹股溝淋巴結未見明顯異常；

組織病理：

肺臟各葉可見多個結核結節，大部分結核結節中央可見干酪樣壞死，周圍類上皮細胞及中性粒細胞、淋巴細胞圍繞，可見郎罕氏巨細胞。結核結節可融合，形成較大病灶。結核結節周圍肺泡腔內充滿漿液性滲出物。支氣管腔內可見粘液膿性物質。以右肺中下葉病變最重。脾臟可見多個結核結節。部分結核結節中央可見干酪樣壞死，周圍類上皮細胞及中性粒細胞、淋巴細胞圍繞，可見郎罕氏巨細胞。肝臟可見多個結核結節。部分結核結節中央可見干酪樣壞死，周圍類上皮細胞及中性粒細胞、淋巴細胞圍繞，可見郎罕氏巨細胞。輕度肝細胞脂肪變性。

腎臟被膜下多灶性炎細胞浸潤，腎小球及腎小管結構破壞。腎組織內可見少數結核結節。附睪可見結核結節，由類上皮細胞、中性粒細胞、淋巴細胞等炎細胞構成。支氣管旁淋巴結可見巨大結核結節，中央為大片干酪樣壞死區，周圍類上皮細胞及中性粒細胞、淋巴細胞圍繞，可見郎罕氏巨細胞。肺門淋巴結可見巨大結核結節，中央為大片干酪樣壞死區，周圍類上皮細胞及中性粒細胞、淋巴細胞圍繞，可見郎罕氏巨細胞。幽門淋巴結可見結核結節，中央為干酪樣壞死，周圍類上皮細胞及中性粒細胞、淋巴細胞圍繞，可見郎罕氏巨細胞。

9 組織菌培養

猴的所有肺葉、肺門淋巴結、支氣管淋巴結的結核菌的荷菌量很高，脾、腎組織中中等水平荷菌量，肝、附睪、腹股溝淋巴結的荷菌量很低。其它組織的菌培養為陰性。在觀察期間肺組織的活檢培養為陽性。

3.1動物的選擇

3周歲以上的健康中國產恒河猴作為實驗的研究對象。由于恒河猴在自然條件下也存在一定比例的結核分支桿菌的感染，為此對進入實驗的恒河猴需要進行體檢。最主要的一項是進行OT測試。舊結核菌素試驗采取猴外眼瞼皮內注射的方式，注射0.1mL舊結核菌素。猴麻醉后，在猴的右上眼瞼皮內注射舊結核菌素（ColoradoSerum Company生產的TuberculinMammalian, Human Isolates Intrademic）0.1mL，注射后24h，48h，72h觀察實驗猴的舊結核菌素反應。

實驗前3只恒河猴未出現紅腫反應，舊結核菌素反應陰性。

3.2動物的飼養和運輸

經OT和X光檢測結核陰性的動物可以進入ABSL-3實驗室。動物麻醉后正常途徑進入。進入負壓猴籠飼養。常規猴糧，高壓滅菌水，每日飼以半個蘋果。溫度和濕度以及光照條件為常規ABSL-3實驗室條件。

感染后猴子的運輸采用專用猴運輸箱，操作參考感染猴運送SOP。

3.3結核分支桿菌的準備

結核分支桿菌的復蘇 從ATCC購買的Erdman菌株（ATCC35810）或結核耐藥株（內部編號94789），自-80℃冰箱取出，融化，用7H9液體培養基稀釋，分裝。取稀釋后的Erdman菌液接種L-J培養基斜面，100μL/支，37℃培養3周，菌落長至合適大小。在斜面上加3-4mL7H9培養基，將菌落自斜面上輕輕刮下，轉移至研磨器中，研磨均勻，將研磨好的菌液適當稀釋，分裝，去一管轉接到L-J斜面生長用于菌落計數，其余菌放-80℃冰箱保存備用。

3.4恒河猴的麻醉和復蘇

在進行纖支鏡和X光檢測時由于操作時間較長，需要使用長效麻藥復方氯胺酮麻醉動物，用生理鹽水1：5稀釋麻藥，稀釋液按照每公斤體重0.1ml的標準肌肉注射麻藥，麻醉動物。實驗結束后肌肉注射蘇醒劑蘇醒3號。具體操作參考SOP。

3.5纖維支氣管鏡的感染操作

動物平放于手術車上，固定四肢。長時間操作需要給動物吸氧。按照纖維支氣管鏡儀器操作規則，在麻醉動物的齒間放入咬合器，通過咬合器從舌與上腭間插入支氣管鏡，注意觀察監視器，找到聲門裂，小心插入支氣管鏡，進入氣管后通過纖支鏡給藥通道注入2ml利多卡因（注射用）。

繼續向下，轉入右側肺至下葉位置。插入感染用纖支鏡噴灑導管，感染劑量100CFU。使用5mL注射器推入2mL菌液，之后再推入3mL空氣，排盡注射導管內的殘余菌液。將纖支鏡連同注射管一同取出，進行清洗。清洗程序注射管推入5mL生理鹽水，再推入消毒酒精5ml，推入清水5ml，推入生理鹽水5ml。取出注射管，纖支鏡用生理鹽水清洗。

檢測感染結核分支桿菌數量，感染用菌液經L-J斜面培養計數。

3.6動物靜脈取血

麻醉動物剪去肘部猴毛，暴露皮膚。酒精面擦拭皮膚表面消毒。5ml注射器靜脈采血，取抗凝血和自凝血。分別分離細胞和血清，進行下列血沉、CRP、細胞因子、流式細胞學抗結核抗體等實驗。血清分離后凍存于低溫冰箱。

3.7動物體溫測定

體溫芯片的植入：準備好芯片掃描儀,檢查是否有電，給體溫芯片編號，將芯片錄入。麻醉動物后，選擇后頸部或上臂近后肩處，酒精棉消毒后，提起皮膚，在皮下植入體溫芯片，檢查芯片固定的位置，是否脫出，消毒進針口。用芯片掃描一下檢驗是否正常。

3.8動物的胸部X光檢查

檢查的頭一天晚上實驗猴禁水食，檢查當天對動物進行麻醉，用數字X光機檢查肺部。使用的參數如下：

選擇狗的模式，設置參數 高度：64cm，厚度：12cm電壓：50kv 電流：1.8~2.4mA之間, 根據猴的大小，固定電壓值，調電流。

3.9 CT

檢查的頭一天晚上實驗猴禁水食，檢查當天對動物進行麻醉，用數字X光機檢查肺部。

在人用的CT機器上選擇幼兒參數模式，調節電壓和電流使圖像分辨率達到要求，如電壓為120kv,電流為350mA。設置參數建立三維圖, 圖像存儲為dicom格式，用軟件計算病變的體積。

3.10 CRP檢測

取全血2ml于血清管中，4℃3000rpm離心20min分離血清。血清中C-反應蛋白測定按照MONKEY C-REACTIVE PROTEIN(CRP)ELISA TEST KIT說明書進行操作，結果以ng/ml表示。具體步驟為：按要求重懸標準品后，依次稀釋成75ng/ml，37.5 ng/ml，18.75ng/ml，9.38 ng/ml，4.69 ng/ml，2.34 ng/ml，1.17 ng/ml和0 ng/ml。將各濃度的標準品和1:1000稀釋后的動物血清分別加至已包被抗體的96孔板中，100ul/孔。室溫孵育45min，洗板后每孔加HRP標記的檢測抗體100ul。室溫孵育45min后，洗板，加TMB 100ul/孔進行顯色。室溫避光顯色20min后加終止液，于450nm處讀取OD值。根據標準曲線計算每只動物感染后不同時間點時血清中的C-反應蛋白含量。

3.11血沉檢測

恒河猴麻醉后，取全血1.6ml于檸檬酸鈉抗凝的血沉管中，顛倒混勻5—8次，垂直插在血沉架上，將血沉管血液的液面與血沉架上的0刻度線對齊，室溫靜置1h后觀察紅細胞下降的mm數。

3.12血清中結核抗體（IgG）的檢測

按照結核分支桿菌抗體診斷試劑盒（膠體金法）使用說明書進行操作：將試劑和反應板取出平衡至室溫，反應板上依次標號。在每個反應孔中加2滴封閉液，待吸收完全后分別加入分離的血清各40ul，之后每孔加入洗滌液各6滴，待吸收完全后每孔加2滴金標液進行顯色。最后每孔加入6滴洗滌液，待吸收完全后目測結果。結果的判定以質控點和反應孔中間同時出現紅色斑點為陽性，若質控點顯示紅色，反應孔中間無紅色斑點出現或僅為痕跡者為陰性。

結核病是由結核分支桿菌（結核菌）引起的一種慢性傳染性疾病，結核感染通常會累及肺、淋巴系統及其它多組織器官。除少數發病急促外，臨床上多呈慢性過程。常有低熱、乏力等全身癥狀和咳嗽、咯血等呼吸系統表現。感染后潛伏期4～8周，其中80%發生在肺部，其他部位（頸淋巴、腦膜、腹膜、腸、皮膚、骨骼）也可繼發感染。

排菌的肺結核患者是傳染源,人與人之間呼吸道傳播是本病傳染的主要方式。大多數的受感染者沒有病癥，稱為潛伏結核感（latentTBinfection），但其中約5-10%的潛伏感染者會發展至活動性結核；若無適當治療，一個活動病例平均每年可使10～15人新受感染，病例本人的死亡率則超過50%。若潛伏感染者同時罹患免疫抑制，如艾滋病，每年就有10%的病發機率。

肺結核病程較復雜，臨床分型有：1、原發型肺結核(Ⅰ型): 肺內滲出病變、淋巴管炎和肺門淋巴結腫大的啞鈴狀改變的原發綜合征。兒童多見，僅表現為肺門和縱隔淋巴結腫大。 2、血型播散型肺結核(Ⅱ型):包括急性血型播散型肺結核及亞急性、慢性血型播散型肺結核。 3、繼發型肺結核(Ⅲ型):可以出現以增殖為主、浸潤為主、干酪病變為主或以空洞為主等多種病理改變。

結核菌進入機體后，被巨噬細胞吞噬，結核菌毒力與宿主免疫力的抗衡決定著結核發病、發展和轉歸。結核病從感染、發病到轉歸均與多數細菌性疾病有顯著不同，宿主反應具有特殊意義，反應分為4期：1.起始期，入侵呼吸道的結核菌被肺泡巨噬細胞吞噬。因菌量、毒力和巨噬細胞非特異性殺菌能力的不同，被吞噬結核菌的命運各異。2.T細胞反應期，由T細胞介導的細胞免疫（CMI）和遲發性過敏反應（DTH）在此期形成，從而對結核病發病、演變及轉歸產生決定性影響。3.共生期，大部分感染者結核菌可以持續存活，細菌與宿主處于共生狀態。纖維包裹的壞死灶干酪樣中央部位被認為是結核桿菌持續存在的主要場所。低氧、低PH和抑制性脂肪酸的存在使細菌不能增殖。宿主的免疫機制亦是抑制細菌增殖的重要因素，倘若免疫損害便可引起受抑制結核菌的重新活動和增殖。4.細胞外增殖和傳播期，固體干酪灶中包含具有生長能力、但不繁殖的結核菌。干酪灶一旦液化便給細菌增殖提供了理想環境。即使免疫功能健全的宿主，從液化干酪灶釋放的大量結核桿菌亦足以突破局部免疫防御機制，引起播散。

結核病的全身癥狀是全身乏力、午后低熱、盜汗、食欲不振、消瘦等；呼吸道癥狀是咳嗽、咳痰、咯血、胸疼、呼吸困難等。其特征性病理改變是肉芽腫病變和結核性結節，其基本病理變化為滲出性病變、增生性病變和壞死性病變。滲出性病變以炎癥細胞、單核細胞肌纖維蛋白為主要成分，增殖性改變以結核結節及結合性肉芽腫為主，壞死的特征性改變為干酪樣改變。結核性炎癥的主要特是上皮樣細胞結節及郎格漢斯細胞。實驗室痰培養為菌陽性，抗酸染色可見細長略彎曲的桿菌，血沉加快。肺的原發病灶、淋巴管炎和肺門淋巴結結核合稱為原發綜合癥，X線影像學上的典型表現為啞鈴狀陰影。感染3-8周后結核菌素皮試轉陽，95%的健康感染者原發綜合征自然消退，成為潛伏感染人群，約5%在日后因潛在感染復燃而發病,結核病起病緩慢，病程較長。