Leptin敲除肥胖癥大鼠模型

該模型通過(guò)長(zhǎng)期觀察普通狼瘡小鼠模型，待其到40周齡時(shí)，檢測(cè)其dsDNA等，結(jié)合皮膚癥狀變化，來(lái)確定慢性狼瘡皮膚病模型的建立。目前國(guó)際上尚欠缺類似模型，為研究狼瘡皮膚病發(fā)病機(jī)制提供了工具。

模型動(dòng)物飼養(yǎng)在武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物房SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特點(diǎn)

門采用專用凈化密閉門并配備觀察窗。單向走道呈順時(shí)針走向設(shè)計(jì)。屏障系統(tǒng)內(nèi)共有大鼠飼養(yǎng)室1間，小鼠飼養(yǎng)室3間，隔離觀察室1間，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室1間，潔物存放室1間，清洗消毒室1間。此外，屏障系統(tǒng)外配有監(jiān)控室、機(jī)房和配電室等。

（2）設(shè)計(jì)參數(shù)

室內(nèi)溫度：20～26°C；日溫差：≤4°C；相對(duì)濕度：40%～70%；換氣次數(shù)：15～20次/h；氣流速度：≤0．2m/s；壓強(qiáng)梯度：20～50Pa；空氣潔凈度：7級(jí)；菌落數(shù)：≤3個(gè)/皿；氨濃度：≤14mg/m3；噪聲：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；動(dòng)物照度：15～20lx；晝夜明暗交替時(shí)間：12/12h。

（3）通風(fēng)和空調(diào)系統(tǒng)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室采用全新風(fēng)中央空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)。空氣經(jīng)過(guò)初、中、三級(jí)過(guò)濾器后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室內(nèi)環(huán)境。

（4）照明系統(tǒng)

一更、淋浴、二更、氣閘、清潔走道、潔物存放處、污物走道、緩沖間和清洗消毒間、動(dòng)物飼養(yǎng)室、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備間、隔離觀察室和功能實(shí)驗(yàn)室等安裝有手動(dòng)和自動(dòng)開(kāi)關(guān)，根據(jù)實(shí)際需要，調(diào)節(jié)控制室內(nèi)照明燈。未啟用房間、清潔走道、潔物存放處、污物走道等在每日中午12點(diǎn)和晚上8點(diǎn)開(kāi)啟紫外線燈照射1h。

（5）通訊系統(tǒng)

因?yàn)镾PF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境和設(shè)施具有特殊要求，人員進(jìn)入后不能隨意出入，而室內(nèi)外的聯(lián)系又十分重要，故室內(nèi)各房間均安裝內(nèi)部電話機(jī)，按照房間順序編排電話號(hào)碼，各室內(nèi)電話可相互連通，并均與監(jiān)控室總機(jī)保持聯(lián)系，保證實(shí)驗(yàn)室內(nèi)外信息的及時(shí)溝通。

（6）監(jiān)控系統(tǒng)

對(duì)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的出入口、走道、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)室、功能操作室等重要位置均安裝了可作270°旋轉(zhuǎn)的攝像機(jī)，能夠及時(shí)了解設(shè)施的運(yùn)行狀態(tài)；也能有效督促實(shí)驗(yàn)人員執(zhí)行科學(xué)的操作規(guī)程，避免人為因素造成室內(nèi)環(huán)境和設(shè)施的污染；并對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間的動(dòng)物狀態(tài)和反應(yīng)進(jìn)行觀察，減少對(duì)動(dòng)物的滋擾。

（7）供水系統(tǒng)

SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲用水以純凈水為宜。本實(shí)驗(yàn)室采用管道供水，將處理后的純凈水用塑膠管道輸送到屏障系統(tǒng)內(nèi)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室，設(shè)置接水槽，為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)滅菌的飲用水和屏障系統(tǒng)內(nèi)用水。要經(jīng)常更換和清洗輸水管道，清洗籠具的用水添加適當(dāng)比例的84消毒液。

（8）供電系統(tǒng)、警報(bào)系統(tǒng)和消防設(shè)施

SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室要求全天候不間斷供風(fēng)和供電，如果出現(xiàn)故障，不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)和處理，就可能導(dǎo)致環(huán)境設(shè)施的污染、動(dòng)物感染或死亡，造成嚴(yán)重后果。因此應(yīng)對(duì)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室使用獨(dú)立穩(wěn)定的供電系統(tǒng)，并配備有應(yīng)急電源。在中央空調(diào)機(jī)房控制室安裝風(fēng)機(jī)故障警報(bào)系統(tǒng)，以便及時(shí)檢修和維護(hù)，保證設(shè)施的安全運(yùn)行。

（9）消毒滅菌設(shè)備

為防止外界物品進(jìn)入SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室時(shí)所攜帶的細(xì)菌污染室內(nèi)環(huán)境和造成動(dòng)物交叉感染，按照不同物品的特性，進(jìn)行紫外線照射消毒、渡槽消毒液消毒或?qū)Ｓ玫臋C(jī)動(dòng)門真空滅菌器消毒。

（10）動(dòng)物飼養(yǎng)籠具

飼養(yǎng)大、小鼠的籠具聚碳酸脂材料的塑膠籠具，具有高透明、耐高壓、耐高溫、耐酸堿等特點(diǎn)。通用的不銹鋼籠具長(zhǎng)、寬、高分別為40、30、20cm，適用于單籠飼養(yǎng)有特殊要求的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，配有底盤(pán)和食槽，確保實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有充足的采食和活動(dòng)空間，同時(shí)也保證室內(nèi)環(huán)境的清潔。

（11）墊料的選擇和使用

在使用塑膠墊料時(shí)，墊料是大小鼠直接接觸的鋪墊物，起到吸濕、保暖和造窩的作用。墊料的好壞直接影響到大小鼠術(shù)后的恢復(fù)、生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖性能。目前，所使用的墊料主要有玉米秸墊料、刨花墊料。

（12）飼料配制

大小鼠的生產(chǎn)型飼料和維持型飼料必須嚴(yán)格按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行科學(xué)配制生產(chǎn)。每半年檢測(cè)一次飼料的微生物指標(biāo)和有效營(yíng)養(yǎng)成分指標(biāo)，保證飼料的質(zhì)量。

1 Leptin敲除大鼠表現(xiàn)肥胖表型

從出生后1月齡始, Leptin敲除大鼠比野生大鼠表現(xiàn)出現(xiàn)顯著的體重增加，1月齡Leptin-/-雌、雄鼠體重比同窩大鼠（Leptin+/+）分別增加了27%和37%，到3月齡時(shí)Leptin-/-雌、雄鼠體重比同窩大鼠（Leptin+/+）增加了38%和39%，6月齡、8月齡時(shí)Leptin-/-雌鼠體重是同窩大鼠（Leptin+/+）的2.3倍，6月齡、8月齡時(shí)Leptin-/-雄鼠的體重是同窩大鼠（Leptin+/+）的1.8倍和2.0倍(見(jiàn)圖1C和圖1D)。MRI結(jié)果也觀察到Leptin-/-大鼠皮下和腹腔脂肪積累的增加（圖1B）。麻醉處死4月齡大鼠，剝離皮下及腹腔脂肪并稱重，證實(shí)Leptin-/-大鼠的皮下和腹腔脂肪的重量分別是Leptin+/+大鼠的20倍和4倍。

圖2 Leptin敲除(Leptin-/-)大鼠表現(xiàn)肥胖。

A：6月齡Leptin+/+大鼠（左）和Leptin-/-大鼠（右）。 B，Leptin-/-大鼠MRI分析,白色部分為高反射的脂肪組織。C：1-8月齡的雌性Leptin+/+（n=5）及Leptin-/- 大鼠（n=5）的體重變化。D：1-8月齡的雄性Leptin+/+（n=4）及Leptin-/- 大鼠（n=2）的體重變化。*，p<0.05。

2 Leptin敲除大鼠肝臟中大量脂肪沉積

取材4、8月齡雌性Leptin-/-大鼠及Leptin+/+大鼠肝臟固定，石蠟包埋及切片，HE染色觀察結(jié)果顯示，4月齡 Leptin-/-大鼠與Leptin+/+大鼠相比，沒(méi)有明顯的病理變化，8月齡 Leptin-/-大鼠肝臟肝小葉中出現(xiàn)大量脂肪空泡，提示肝細(xì)胞脂肪變性。

圖3 Leptin-/-大鼠肝臟組織脂肪變性（40×）。

4M ,4月齡雌性Leptin-/-大鼠（n=2）及Leptin+/+大鼠（n=2）； 8M ，8月齡雌性Leptin-/-大鼠（n=2）及Leptin+/+大鼠（n=2）。

3 雌性Leptin敲除大鼠空腹血糖升高

比較出生后1月齡至8月齡，Leptin+/+雌鼠和Leptin-/-雌鼠的空腹血糖值（見(jiàn)圖2）。雌鼠自1月齡起，Leptin-/-大鼠的空腹血糖值就顯著高于Leptin+/+大鼠（40%），3月齡比Leptin+/+大鼠高33%，6月齡血糖降低但仍然比Leptin+/+大鼠高26%，8月齡時(shí)比野生大鼠高出11%，高血糖表型可以維持5個(gè)月以上。雄性Leptin+/+大鼠和Leptin-/-大鼠的空腹血糖值沒(méi)有顯著差異。

圖4 Leptin-/-基因敲除大鼠空腹血糖受損。

1,3,6,8月齡的雌性Leptin-/-大鼠（n=5）及Leptin+/+大鼠（n=5）的空腹血糖變化。*，p<0.05。

4 Leptin敲除大鼠出現(xiàn)明顯的胰島素抵抗

4月齡時(shí)，對(duì)Leptin-/-大鼠進(jìn)行糖耐受實(shí)驗(yàn)(圖4a)和胰島素耐受實(shí)驗(yàn)(圖4b)，測(cè)定結(jié)果顯示4月齡的Leptin-/-大鼠就出現(xiàn)了明顯的高胰島素血癥及胰島素抵抗的癥狀。

圖5，4月齡Leptin-/-大鼠的糖耐受曲線和葡萄糖刺激下的胰島素曲線

Leptin-/-大鼠和Leptin+/+的腹腔糖耐受曲線(n=5)；b，葡萄糖刺激下的胰島素曲線(n=5)；

5 Leptin敲除大鼠胰島增生

取材4、8月齡雌性Leptin-/-大鼠及Leptin+/+大鼠的胰腺組織固定，石蠟包埋及切片，H&E染色觀察基因敲除大鼠胰腺病理學(xué)變化（見(jiàn)圖4）。結(jié)果顯示，6月齡 Leptin-/-大鼠與Leptin+/+大鼠相比，胰島體積增大，但是數(shù)量增多不明顯，且胰腺也沒(méi)有脂肪細(xì)胞浸潤(rùn)，而8月齡Leptin-/-大鼠胰島數(shù)量明顯增多，體積增大更顯著，胰腺內(nèi)較多脂肪細(xì)胞浸潤(rùn)，胰島形態(tài)由于快速擴(kuò)張而極不規(guī)則。胰島素抗體免疫組化顯示，4、8月齡Leptin-/-大鼠β細(xì)胞增多，胰島素分泌大大增加（見(jiàn)圖5）。

圖6 Leptin-/- 大鼠胰腺組織胰島病理學(xué)觀察。

4M,4月齡雌性Leptin-/-大鼠（n=2）及Leptin+/+大鼠（n=2）； 8M ，8月齡雌性Leptin-/-大鼠（n=2）及Leptin+/+大鼠（n=2）。

瘦素基因(Leptin)敲除大鼠

背景品系為SD(Sprague Dawley, SD)大鼠，為大鼠（rat；rattus norregicus）的一個(gè)品系，屬于動(dòng)物界、脊索動(dòng)物門、脊椎動(dòng)物亞門、哺乳綱、嚙齒目、鼠科、大家鼠屬（Genus Rattus）、大家鼠種（Speciesrattus norvegicus）的動(dòng)物，1925年，美國(guó)斯?jié)娎鄹?多雷（Sprague Dawley）農(nóng)場(chǎng)用Wistar大鼠培育而成。

利用TALENs和顯微注射技術(shù),獲得一只在Leptin編碼區(qū)418- 425位堿基缺失的大鼠，由于同時(shí)產(chǎn)生了TGA終止密碼子(圖1b)，導(dǎo)致該蛋白C末端缺失了28個(gè)氨基酸。

圖1 western blot檢測(cè)Leptin+/+大鼠和Leptin-/-大鼠肝臟中l(wèi)eptin的表達(dá)。

一、疾病名稱

肥胖癥(obesity)是一種由多種因素引起的慢性代謝性疾病,以體內(nèi)脂肪細(xì)胞的體積和細(xì)胞數(shù)增加,從而導(dǎo)致體脂占體重的百分比異常增高并在某些局部過(guò)多沉積脂肪為特點(diǎn),早在1948年,WHO已將肥胖癥列入疾病分類名單,2000年,WHO將吸煙,肥胖和艾滋病列為人類的三大殺手。

二、疾病臨床表現(xiàn)及致病機(jī)制

肥胖癥可以引發(fā)生理,心理和社會(huì)問(wèn)題,已證實(shí)肥胖癥是心腦血管疾病, 胰島素抵抗, 2型糖尿病,某些癌癥的重要危險(xiǎn)因素。

（1）肥胖癥與心血管系統(tǒng)肥胖癥患者并發(fā)冠心病、高血壓的幾率明顯高于非肥胖者，其發(fā)生率一般5～10倍于非肥胖者，尤其腰臀比值高的中心型肥胖患者。

（2）肥胖癥的糖、脂代謝進(jìn)食過(guò)多的熱量促進(jìn)三酰甘油的合成和分解代謝，肥胖癥的脂代謝表現(xiàn)得更加活躍，相對(duì)糖代謝受到抑制，這種代謝改變參與胰島素抵抗的形成。肥胖癥脂代謝活躍的同時(shí)多伴有代謝的紊亂，會(huì)出現(xiàn)高三酰甘油血癥、高膽固醇血癥和低高密度脂蛋白膽固醇血癥等。糖代謝紊亂表現(xiàn)為糖耐量的異常甚至出現(xiàn)臨床糖尿病

（3）肥胖癥與胰島素抵抗體脂堆積可引起胰島素抵抗、高胰島素血癥。

（4）其他肥胖者嘌呤代謝異常，血漿尿酸增加，使痛風(fēng)的發(fā)病率明顯高于正常人，伴冠心病者有心絞痛發(fā)作史。肥胖者血清總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇常升高，高密度脂蛋白膽固醇降低，易導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化。由于靜脈循環(huán)障礙，易發(fā)生下肢靜脈曲張、栓塞性靜脈炎、靜脈血栓形成。