MSG1基因敲除肥胖癥小鼠模型

該模型通過(guò)長(zhǎng)期觀察普通狼瘡小鼠模型，待其到40周齡時(shí)，檢測(cè)其dsDNA等，結(jié)合皮膚癥狀變化，來(lái)確定慢性狼瘡皮膚病模型的建立。目前國(guó)際上尚欠缺類(lèi)似模型，為研究狼瘡皮膚病發(fā)病機(jī)制提供了工具。

模型動(dòng)物飼養(yǎng)在武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物房SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特點(diǎn)

門(mén)采用專(zhuān)用凈化密閉門(mén)并配備觀察窗。單向走道呈順時(shí)針走向設(shè)計(jì)。屏障系統(tǒng)內(nèi)共有大鼠飼養(yǎng)室1間，小鼠飼養(yǎng)室3間，隔離觀察室1間，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室1間，潔物存放室1間，清洗消毒室1間。此外，屏障系統(tǒng)外配有監(jiān)控室、機(jī)房和配電室等。

（2）設(shè)計(jì)參數(shù)

室內(nèi)溫度：20～26°C；日溫差：≤4°C；相對(duì)濕度：40%～70%；換氣次數(shù)：15～20次/h；氣流速度：≤0．2m/s；壓強(qiáng)梯度：20～50Pa；空氣潔凈度：7級(jí)；菌落數(shù)：≤3個(gè)/皿；氨濃度：≤14mg/m3；噪聲：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；動(dòng)物照度：15～20lx；晝夜明暗交替時(shí)間：12/12h。

（3）通風(fēng)和空調(diào)系統(tǒng)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室采用全新風(fēng)中央空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)。空氣經(jīng)過(guò)初、中、三級(jí)過(guò)濾器后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室內(nèi)環(huán)境。

（4）照明系統(tǒng)

一更、淋浴、二更、氣閘、清潔走道、潔物存放處、污物走道、緩沖間和清洗消毒間、動(dòng)物飼養(yǎng)室、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備間、隔離觀察室和功能實(shí)驗(yàn)室等安裝有手動(dòng)和自動(dòng)開(kāi)關(guān)，根據(jù)實(shí)際需要，調(diào)節(jié)控制室內(nèi)照明燈。未啟用房間、清潔走道、潔物存放處、污物走道等在每日中午12點(diǎn)和晚上8點(diǎn)開(kāi)啟紫外線(xiàn)燈照射1h。

（5）通訊系統(tǒng)

因?yàn)镾PF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境和設(shè)施具有特殊要求，人員進(jìn)入后不能隨意出入，而室內(nèi)外的聯(lián)系又十分重要，故室內(nèi)各房間均安裝內(nèi)部電話(huà)機(jī)，按照房間順序編排電話(huà)號(hào)碼，各室內(nèi)電話(huà)可相互連通，并均與監(jiān)控室總機(jī)保持聯(lián)系，保證實(shí)驗(yàn)室內(nèi)外信息的及時(shí)溝通。

（6）監(jiān)控系統(tǒng)

對(duì)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的出入口、走道、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)室、功能操作室等重要位置均安裝了可作270°旋轉(zhuǎn)的攝像機(jī)，能夠及時(shí)了解設(shè)施的運(yùn)行狀態(tài)；也能有效督促實(shí)驗(yàn)人員執(zhí)行科學(xué)的操作規(guī)程，避免人為因素造成室內(nèi)環(huán)境和設(shè)施的污染；并對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間的動(dòng)物狀態(tài)和反應(yīng)進(jìn)行觀察，減少對(duì)動(dòng)物的滋擾。

（7）供水系統(tǒng)

SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲用水以純凈水為宜。本實(shí)驗(yàn)室采用管道供水，將處理后的純凈水用塑膠管道輸送到屏障系統(tǒng)內(nèi)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室，設(shè)置接水槽，為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)滅菌的飲用水和屏障系統(tǒng)內(nèi)用水。要經(jīng)常更換和清洗輸水管道，清洗籠具的用水添加適當(dāng)比例的84消毒液。

（8）供電系統(tǒng)、警報(bào)系統(tǒng)和消防設(shè)施

SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室要求全天候不間斷供風(fēng)和供電，如果出現(xiàn)故障，不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)和處理，就可能導(dǎo)致環(huán)境設(shè)施的污染、動(dòng)物感染或死亡，造成嚴(yán)重后果。因此應(yīng)對(duì)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室使用獨(dú)立穩(wěn)定的供電系統(tǒng)，并配備有應(yīng)急電源。在中央空調(diào)機(jī)房控制室安裝風(fēng)機(jī)故障警報(bào)系統(tǒng)，以便及時(shí)檢修和維護(hù)，保證設(shè)施的安全運(yùn)行。

（9）消毒滅菌設(shè)備

為防止外界物品進(jìn)入SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室時(shí)所攜帶的細(xì)菌污染室內(nèi)環(huán)境和造成動(dòng)物交叉感染，按照不同物品的特性，進(jìn)行紫外線(xiàn)照射消毒、渡槽消毒液消毒或?qū)Ｓ玫臋C(jī)動(dòng)門(mén)真空滅菌器消毒。

（10）動(dòng)物飼養(yǎng)籠具

飼養(yǎng)大、小鼠的籠具聚碳酸脂材料的塑膠籠具，具有高透明、耐高壓、耐高溫、耐酸堿等特點(diǎn)。通用的不銹鋼籠具長(zhǎng)、寬、高分別為40、30、20cm，適用于單籠飼養(yǎng)有特殊要求的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，配有底盤(pán)和食槽，確保實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有充足的采食和活動(dòng)空間，同時(shí)也保證室內(nèi)環(huán)境的清潔。

（11）墊料的選擇和使用

在使用塑膠墊料時(shí)，墊料是大小鼠直接接觸的鋪墊物，起到吸濕、保暖和造窩的作用。墊料的好壞直接影響到大小鼠術(shù)后的恢復(fù)、生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖性能。目前，所使用的墊料主要有玉米秸墊料、刨花墊料。

（12）飼料配制

大小鼠的生產(chǎn)型飼料和維持型飼料必須嚴(yán)格按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行科學(xué)配制生產(chǎn)。每半年檢測(cè)一次飼料的微生物指標(biāo)和有效營(yíng)養(yǎng)成分指標(biāo)，保證飼料的質(zhì)量。

1. 動(dòng)物整體代謝表型分析

分別飼喂MSG1基因敲除小鼠和對(duì)照小鼠45%脂肪含量的高脂飼料(HFD) 和常規(guī)對(duì)照飼料(SD)，喂食14周。期間每周測(cè)量小鼠體重并做好記錄，給予高脂飼料12周后測(cè)量葡萄糖耐量（GTT）和胰島素耐量（ITT）、代謝籠、食物攝入量等生理指標(biāo)（圖1）。結(jié)果顯示MSG1基因敲除小鼠顯著抵抗高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖。具體表現(xiàn)為：與對(duì)照小鼠相比體重減輕、脂肪組織量減少、糖代謝改善、

圖1: MSG1基因敲除小鼠抵抗高脂誘導(dǎo)的肥胖表型。A 體重；B 骨骼肌組織重；C 脂肪組織重；D GTT；E ITT；F 能量消耗；G 二氧化碳呼出量；H 運(yùn)動(dòng)量；I 食物攝入量。

2. 脂肪和骨骼肌代謝分析

脂肪組織進(jìn)行H.E.染色，統(tǒng)計(jì)脂肪細(xì)胞大小及脂滴大小并檢測(cè)代謝相關(guān)基因（圖2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSG1基因敲除小鼠脂肪細(xì)胞體積顯著減小且發(fā)生棕色化現(xiàn)象。骨骼肌脂質(zhì)含量檢測(cè)及骨骼肌代謝能力評(píng)估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSG1基因敲除小鼠骨骼肌組織氧化代謝能力增強(qiáng)（圖3）。

圖2: MSG1基因敲除小鼠脂肪組織表型及代謝基因檢測(cè)。A H.E.染色；B-D qPCR檢測(cè)代謝基因；E 脂肪組織UCP1免疫組化；F 脂肪組織Western Blot。

圖3： MSG1基因敲除小鼠骨骼肌組織代謝基因檢測(cè)。A-C qPCR檢測(cè)代謝基因。

1.MSG1基因敲除小鼠模型的制備

設(shè)計(jì)并構(gòu)建MSG1的sgRNA，進(jìn)行體外細(xì)胞水平測(cè)試sgRNA活性，設(shè)計(jì)并構(gòu)建Donor載體，顯微注射和移植，待F0代小鼠出生后鑒定小鼠基因型，選擇陽(yáng)性小鼠繼續(xù)繁育。

2.高脂飲食喂養(yǎng)

6周齡雄性的MSG1基因敲除小鼠和野生型小鼠飼喂45%脂肪含量的高脂飼料，同時(shí)設(shè)置正常飼料組作對(duì)照。

肥胖是指一定程度的明顯超重與脂肪層過(guò)厚，是體內(nèi)脂肪，尤其是甘油三酯積聚過(guò)多而導(dǎo)致的一種狀態(tài)。它不是指單純的體重增加，而是體內(nèi)脂肪組織積蓄過(guò)剩的狀態(tài)。由于食物攝入過(guò)多或機(jī)體代謝的改變而導(dǎo)致體內(nèi)脂肪積聚過(guò)多造成體重過(guò)度增長(zhǎng)并引起人體病理、生理改變或潛伏。

骨骼肌、脂肪及肝臟是機(jī)體的三大主要代謝器官。特別是骨骼肌作為機(jī)體最大的代謝器官和分泌器官，其自身代謝及其通過(guò)分泌各種細(xì)胞因子遠(yuǎn)距離調(diào)控脂肪組織和肝臟代謝對(duì)于調(diào)控和維持機(jī)體能量代謝起到十分重要的作用。

MSG1是骨骼肌特異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，對(duì)骨骼肌代謝具有重要調(diào)控作用，同時(shí)通過(guò)調(diào)控骨骼肌分泌肌因子介導(dǎo)系統(tǒng)能量代謝穩(wěn)態(tài)。MSG1基因敲除小鼠的基礎(chǔ)代謝率提高，當(dāng)給予高脂飲食時(shí)，MSG1基因敲除小鼠顯著抵抗高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖。因此，MSG1基因敲除小鼠是探討高脂飲食誘導(dǎo)肥胖的分子機(jī)制研究的良好動(dòng)物模型。