TBX6相關先天性脊柱側凸小鼠模型

該模型采用了CRISPR/Cas9技術，創新性地結合了人類遺傳學與動物基因編輯技術，首次在小鼠上重構了與人類疾病類似的遺傳模式，在Tbx6基因上同時引入無效突變和promotor區域的亞效等位基因，并將二者結合，形成復合雜合突變并獲得相應的脊柱畸形表型。該模型是國際上首創的復合雜合突變脊柱畸形表型，對于解釋先天性脊柱側凸的分子機制和發病過程具有極高的研究討論價值。

該基因編輯小鼠將在屏障隔離環境（北京協和醫院實驗動物中心）內進行繁育、飼養及相關實驗，其監督管理措施由動物中心負責。屏障隔離期間將保持清潔，保證其具有SPF級別清潔度，減少感染及發病幾率。嚴格實驗室管理，防止小鼠外泄，實驗設計時將禁止其與野生型小鼠交配，保證編輯基因組序列不向自然界流通。上述措施將保證該動物模型的生物安全性，避免其影響生態環境。

1. 劑量依賴性的先天性椎體畸形復合遺傳模型

使用小鼠胚胎的體內測定，我們展示了劑量依賴性的先天性椎體畸形復合遺傳模型。該模型由Tbx6無效等位基因 (?) 和亞等位基因（mh）組成。(A) 阿爾新藍染色的E14.5小鼠胚胎的背面視圖。顯示了一個沒有明顯椎體畸形的胚胎。(B) 顯示了一個具有椎體畸形的胚胎。紅點和箭頭分別表示椎體畸形和肋骨融合。比例尺為1mm。 (C) 在Tbx6 + / +，Tbx6 + / mh，Tbx6 mh / mh或Tbx6 + / ? 的E14.5小鼠胚胎中未觀察到明顯的椎體畸形，而Tbx6 mh / ? 胚胎表現出高穿透率的椎體畸形。樣本量顯示在下面的列中。****，P ＜0.0001。

2. 成年小鼠的Micro-CT結果

成年小鼠的Micro-CT結果。(A) 通過Micro-CT掃描顯示成年小鼠的背側和腹側圖像，未見明顯椎體畸形。(B) 通過Micro-CT掃描顯示一只具有椎體畸形的小鼠。 白色箭頭和箭頭分別指示椎體畸形和肋骨融合。(C) Tbx6 + / +，Tbx6 + / mh，Tbx6 mh / mh，Tbx6 + / + 和Tbx6 mh / ? 基因型的成年小鼠Micro-CT圖像。 樣本量顯示在每列下方。 ****，P ＜0.0001。

FVB/NJ品系基因敲除小鼠。

采用CRISPR-Cas9技術編輯小鼠基因組。表 1中顯示了小鼠基因組中指導RNA的靶標。我們混合了向導RNA和Cas9mRNA（每個RNA 10 ng /μl），注射到FVB / NJ品系小鼠的合子（每次注射編輯200個細胞）。取得F0小鼠后，與野生型FVB / NJ小鼠雜交以獲得后代。我們使用來自腳趾的基因組DNA，通過PCR和Sanger測序對小鼠進行基因分型。用于擴增和測序的PCR引物在表 2中顯示。

表 1. 小鼠基因組中單向導RNA（sgRNA）的靶序列。

表 2. 小鼠Tbx6基因分型的引物。

先天性脊柱側凸即通過X線，MRI或手術證實的特定的先天性椎體異常而引起的脊柱側凸。這種畸形出生后即發病，因而患者出現畸形較特發性脊柱側凸早。早期發病使先天性脊柱側凸患者很少能接受到早期最佳的治療。由于形成的彎曲易于進展，并且患者仍有較長的生長期，所以容易產生較嚴重的畸形。先天性脊柱側凸通常較僵硬，難于矯正。根據畸形的類型對脊柱側凸進行分型，主要分為形成障礙，分節不良和混合畸形。形成障礙最典型的例子即半椎體；典型的分節不良為骨橋，即兩個或多個椎體一側或雙側的骨性連接；混合型即同一患者同時具有以上2種畸形。