杜氏肌營養不良小鼠模型

該模型采用了CRISPR/Cas9技術，創新性地結合了人類遺傳學與動物基因編輯技術，首次在小鼠上重構了與人類疾病類似的遺傳模式，在Tbx6基因上同時引入無效突變和promotor區域的亞效等位基因，并將二者結合，形成復合雜合突變并獲得相應的脊柱畸形表型。該模型是國際上首創的復合雜合突變脊柱畸形表型，對于解釋先天性脊柱側凸的分子機制和發病過程具有極高的研究討論價值。

該基因編輯小鼠將在屏障隔離環境（北京協和醫院實驗動物中心）內進行繁育、飼養及相關實驗，其監督管理措施由動物中心負責。屏障隔離期間將保持清潔，保證其具有SPF級別清潔度，減少感染及發病幾率。嚴格實驗室管理，防止小鼠外泄，實驗設計時將禁止其與野生型小鼠交配，保證編輯基因組序列不向自然界流通。上述措施將保證該動物模型的生物安全性，避免其影響生態環境。

小鼠表現為血清中高水平的肌酸激酶，骨骼肌纖維Evans-blue 摻入陽性。骨骼肌跑步運動能力減弱、抓力減弱、骨骼肌纖維張力減弱。

（1） 血清CK檢測

肌酸激酶在骨骼肌膜完整時不會釋放到血液中，Mdx肌營養不良的小鼠由于肌營養不良蛋白的功能缺失，肌纖維膜受損，肌酸激酶會從骨骼肌組織中釋放出來，表現為血清中肌酸激酶的水平升高。

（2） 伊文氏蘭(Evens Blue)染色

Evens-Blue是一種經激發可產生紅色熒光的染料。完整的肌纖維表現為染料摻入陰性，受損傷的肌纖維表現為染料摻入陽性。由于Mdx小鼠骨骼肌纖維膜不完整，因此，腹腔注射Evens-blue染料，取Mdx小鼠骨骼肌切片，可以檢測到較多Evens-blue陽性區域。

（3） 骨骼肌力量測試

Mdx小鼠肌纖維結構的不完整，也導致了小鼠骨骼肌功能的減弱。取出完整的趾長伸肌的肌群，進行肌肉力量的電生理實驗，Mdx小鼠表現為骨骼肌張力的減弱。用抓力測量儀對小鼠的抓力進行測量，Mdx小鼠表現為前后肢抓力的減弱。

（4） 跑步實驗

Mdx小鼠的骨骼肌耐力減弱，在進行跑步實驗時，小鼠的運動時間和運動距離會顯著減少。

（5） 病理診斷

由于Mdx小鼠經歷反復的骨骼肌損傷修復，骨骼肌組織內會出現較多的炎胞浸潤以及纖維化。

SPF級C57BL/6j

Mdx小鼠（C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J）

Mdx小鼠是模擬人類的骨骼肌營養不良的小鼠模型，該小鼠由于DMD基因的自發性點突變。

（1） Mdx小鼠是位于X染色體的DMD基因第23個外顯子上的自發性無義突變的小鼠模型；雌性個體純和突變表現為肌營養不良表型（X^{dmdXdmd）、雄性個體只有一條X染色體，攜帶突變即可表現為肌營養不良表型（XdmdY）。一般用雄性Mdx小鼠做研究。}

（2） 將雌性雜合子（X^{dmdX+）與C57BL/6j雄性小鼠雜交，產生的子代雄性個體中：1/2為Mdx小鼠，1/2野生型。}

杜氏肌營養不良是一種進行性的骨骼肌衰弱疾病，發病率在男性兒童中占3500-3600分之一。本病的發生是由于X染色體上編碼肌營養不良蛋白的DMD基因的突變所引起。肌營養不良蛋白是組成對于維持肌纖維的結構穩定性非常重要的膜復合物的成員之一。DMD基因的變異包括缺失、重復或點突變。目前沒有有效的針對發病原因的藥物。

患者在兒童早期主要表現為小腿腓腸肌假性肥大、鴨步和Gowers征，因骨骼肌不斷退化出現肌肉無力或萎縮并且迅速惡化。在患者生長發育過程中，可能表現為運動能力的發育較正常人遲緩，相對于同齡兒童，包括坐、站、走等這些運動表型都要晚。疾病的快速發展會導致患者在青春期基本就要靠輪椅活動。DMD同時危及心肌和呼吸肌的功能，患者晚期可出現全身骨骼肌萎縮，大概在7歲到12歲時會徹底喪失獨立行走能力，通常在20歲左右會因為心肌、肺肌無力（心力衰竭或呼吸衰竭）而死亡。