G蛋白偶聯受體激酶4轉基因高血壓小鼠模型

動物癥狀觀察：

表現為體重減輕、弓背豎毛，在回輸后的一個月后死亡。

（一）GRK4γ wt/R65L/A142V/A486V 轉基因小鼠基因型及表型

提取小鼠基因組DNA，用PCR法擴增623bp的目的片段，鑒定小鼠基因型（圖1A）。提取心臟、腎臟和腎上腺組織總蛋白，用GRK4抗體進行Western Blot分析，確定轉基因小鼠GRK4的高表達（圖1B）。通過比較對照組（NTG）和轉基因小鼠中GRK4表達水平，篩選到在心臟、腎臟和腎上腺均高表達GRK4基因的轉基因小鼠品系。

圖1 GRK4γ野生型基因和三種GRK4γ基因突變轉基因小鼠的建立

A. PCR鑒定GRK4γ野生型基因和三種GRK4γ基因突變轉基因小鼠基因型；1為空白對照；2為陰性對照；3為陽性對照；5、8、11、13為陽性轉基因小鼠；4、6、7、9、10、12為陰性轉基因小鼠。

B. Western Blot分析GRK4蛋白在轉基因小鼠心臟、腎臟和腎上腺組織中的表達，GAPDH為內參；

（二）正常飲食GRK4γ野生型、GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V轉基因小鼠血壓動態對比分析

NTG 和轉基因陽性小鼠于2、4和8月齡進行血壓動態分析。結果顯示，NTG和轉基因陽性小鼠平均動脈血壓（mean arterial pressure, MBP）[平均動脈血壓＝舒張壓＋1/3（收縮壓﹣舒張壓）]均隨著年齡的增長而增加。與NTG小鼠相比，GRK4γ野生型和GRK4γR65L轉基因小鼠血壓正常；GRK4γA142V轉基因小鼠在8月齡時血壓顯著升高（P=0.009）；而GRK4γA486V轉基因小鼠在正常的鈉鹽攝入情況下并未出現高血壓表型（圖2）。說明，外源性轉入人源GRK4γ野生型、GRK4γR65L和GRK4γA486V突變不會影響正常鈉鹽攝入情況下血壓水平，而GRK4γA142V突變即使在正常鈉鹽攝入情況下仍會引起血壓升高。

圖2 正常飲食GRK4γ野生型基因和三種GRK4γ基因突變的轉基因小鼠血壓動態對比分析（注：*P<0.01；**P<0.01）

（三）高鹽飲食GRK4γA486V轉基因小鼠血壓動態對比分析

于2月齡時將NTG和GRK4γA486V轉基因小鼠隨機分成四組，即NTG正常飲食組（N=8）、GRK4γA486V正常飲食組（N=5）、NTG高鹽飲食組（N=6）和GRK4γA486V高鹽飲食組（N=6）。正常膳食飲食組飼料中氯化鈉含量為0.06%，高鹽飲食組飼料中氯化鈉含量為4%，連續喂養4周后恢復正常飲食，并對各組小鼠進行血壓動態分析。結果顯示，經過高鹽飲食刺激，與正常飲食組NTG小鼠相比，高鹽飲食組NTG小鼠MBP雖有所升高但無顯著性差異；而高鹽飲食組GRK4γA486V轉基因小鼠較正常飲食組GRK4γA486V轉基因小鼠MBP顯著升高（P=0.0007），且MBP變化值為7.53mmHg（圖3）。臨床上，將因鈉鹽攝入量增多而導致的MBP升高值≥ 7mmHg的高血壓定義為鹽敏感性高血壓。由此可知，GRK4γA486V突變誘導高血壓屬于鹽敏感性高血壓。

圖3 高鹽飲食GRK4γA486V轉基因小鼠血壓動態對比分析

多巴胺和腎素-血管緊張素系統是兩個最主要的血壓調控途徑，二者與細胞間第二信使系統協同調節體內水鈉平衡，GRK4（G蛋白偶聯受體激酶4G-protein-coupled receptor kinase 4, GRK4）則在多巴胺介導的尿鈉排泄中發揮重要的作用。GRK4是唯一有4個剪接變異體（GRK4α,β, γ和δ）的GRKs家族成員，編碼GRK4的基因定位4p16.3，該位點已被證實與高血壓的發生相關。GRK4的突變與腎臟促尿鈉排泄功能受損和高血壓的發生密切相關，其中R65L（rs2960306）、A142V（rs1024323）和A486V（rs1801058）是現階段研究頻率較高的三個突變。在對中國北方漢族人群的研究中發現，GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V的同時存在可使高血壓的發生風險較無突變人群高6倍。

目前建立的人GRK4γ野生型、GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V四種基因轉基因小鼠，對其進行血壓動態對比分析。結果發現，GRK4γ野生型和GRK4γR65L突變轉基因小鼠血壓正常；GRK4γA142V突變轉基因小鼠在正常的鈉鹽攝入情況下即可發生高血壓，而GRK4γA486V突變轉基因小鼠只有在增加鈉鹽攝入情況下才發生高血壓，說明GRK4γ的不同突變會引起不同類型的高血壓。

用PCR的方法克隆人GRK4γ野生型、GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V四種基因的開放閱讀框，，均插入系統性表達的啟動子下游構建人GRK4γ野生型、GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V四種表達載體。用顯微注射法將四種轉基因載體分別注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，制備四種轉基因小鼠。

一、疾病名稱

高血壓是以體循環動脈壓增高為主要表現的臨床綜合征，是嚴重危害人類健康的常見心血管病之一，目前高血壓患者約有10億，如不采取積極有效的預防措施，預計到2025年，的高血壓患者可能會再增加80%。此外，高血壓還是腦卒中、心肌梗死等心血管疾病以及慢性腎臟疾病等最主要的危險因素。因此，高血壓已經成為威脅人類生命健康的重要的公共衛生問題，其防治具有重要的現實意義。

二、疾病臨床表現及致病機制

高血壓的癥狀因人而異。早期可能無癥狀或癥狀不明顯，僅僅會在勞累、精神緊張、情緒波動后發生血壓升高，并在休息后恢復正常。隨著病程延長，血壓明顯的持續升高，逐漸會出現各種癥狀。此時被稱為緩進型高血壓病。緩進型高血壓病常見的臨床癥狀有頭痛、頭暈、注意力不集中、記憶力減退、肢體麻木、夜尿增多、心悸、胸悶、乏力等。當血壓突然升高到一定程度時甚至會出現劇烈頭痛、嘔吐、心悸、眩暈等癥狀，嚴重時會發生神志不清、抽搐。這就屬于急進型高血壓和高血壓危重癥，多會在短期內發生嚴重的心、腦、腎等器官的損害和病變，如中風、心梗、腎衰等。癥狀與血壓升高的水平并無一致的關系。

高血壓有兩種情況，一種是原發性高血壓，一種是繼發性高血壓。基于目前的醫學發展水平和檢查手段，能夠發現導致血壓升高的確切病因，稱之為繼發性高血壓；反之，不能發現導致血壓升高的確切病因，則稱為原發性高血壓，占血壓高總人數的90%～95%。高血壓人群中多數為原發性高血壓，但明確診斷原發性高血壓，需首先除外繼發性高血壓。繼發性高血壓是由于某種具體的疾病引起的血壓高，病因是清楚而明了的，大約占高血壓總數的5%～10%，一般多由腎實質病變、腎動脈狹窄、嗜鉻細胞瘤、原發性醛固酮增多癥、庫欣綜合征、主動脈縮窄等疾病引起。

目前認為原發性高血壓是一種某些先天性遺傳基因與許多致病性增壓因素和生理性減壓因素相互作用而引起的多因素疾病。這些因素主要包括：遺傳因素；高鈉、低鉀膳食；超重和肥胖；飲酒；精神緊張及其他危險因素包括年齡、缺乏體力活動等。

2005年美國高血壓學會（ASH）提出，高血壓是一個由許多病因引起的處于不斷進展狀態的心血管綜合征，可導致心臟和血管功能與結構的改變。因此，原發性高血壓治療的主要目的是最大限度地降低心血管的死亡和病殘的總危險。