柯薩奇病毒A10型腹腔感染小鼠模型

本課題組采用7日齡ICR乳鼠、經(jīng)腹腔注射CA10病毒的感染途徑，成功獲得CA10病毒感染小鼠模型。模型建立過程中采用臨床評分標準對感染后動物的臨床癥狀進行評價，并記錄死亡率和體重情況；同時采用熒光定量PCR-標準曲線法對感染后動物血液和組織中的病毒載量進行測定，以確定病毒的復(fù)制情況。

本CA10病毒感染小鼠模型與文獻報道的泰山醫(yī)學(xué)院的史衛(wèi)峰教授課題組的ICR乳鼠感染模型，都采用國際通用的封閉群ICR小鼠的乳鼠作為感染對象，都得到了具有典型神經(jīng)系統(tǒng)病癥的小鼠感染重癥模型。在感染4天后動物出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，包括駝背或炸毛，后肢無力，單后肢癱瘓，雙后肢癱瘓，嚴重的直至死亡；之后幾日臨床評分不斷升高，最終感染小鼠全部死亡。采集感染小鼠的血液和后肢肌肉組織樣本，檢測到病毒載量從第1天的低于檢測水平（<200 copies/ul）上升到第3天的高水平（>106 copies/μl），說明病毒在機體內(nèi)的大量復(fù)制擴增；尤其是在肌肉組織中病毒載量的結(jié)果與臨床癥狀相吻合。兩者的不同之處在于：使用的病毒株不同，來自于不同病人的臨床分離株；小鼠的日齡不同，我們使用7日齡的ICR乳鼠，相對于5日齡小鼠更易于操作；感染途徑不同，我們采用腹腔注射感染的方式，而非采用肌肉注射感染方式，更有利于觀察和研究CA10病毒的嗜肌性。

CA10病毒感染模型的建立需要確定乳鼠的日齡和感染的劑量。由于CA10病毒對5歲以下兒童易感，相應(yīng)的CA10病毒也只能使乳鼠在感染后表現(xiàn)出癥狀。我們試驗了7日齡和10日齡的乳鼠，發(fā)現(xiàn)10日齡乳鼠感染后癥狀表現(xiàn)不穩(wěn)定，因此選取了7日齡乳鼠作為感染動物。對于病毒感染劑量，我們也嘗試了103、104、105 TCID50，選擇了癥狀更為合適和穩(wěn)定的104 TCID50。由于近幾年CA10病毒成為我國手足口病的主要病原之一，引起廣泛關(guān)注；而CA10病毒感染小鼠模型不僅可用于研究病毒的感染機制和機體的免疫反應(yīng)，更是開發(fā)相應(yīng)的特異性藥物和疫苗的重要基礎(chǔ)。

CA10病毒在人間傳染病名錄中屬于第三類，涉及的實驗需在BSL-2實驗室進行，動物實驗在ABSL-2實驗室開展。CA10病毒已經(jīng)過風(fēng)險評估，具有相應(yīng)標準操作程序。

CA10病毒對5歲以下兒童易感，主要通過糞口傳播，對于具有BSL-2防護裝備的實驗人員危害較小；實驗人員均經(jīng)過生物安全培訓(xùn)獲得證書；進入動物房之前，穿戴防護服、口罩、帽子、鞋套，防護眼鏡等進行防護；實驗結(jié)束后按要求去除防護設(shè)備集中處理。

成年ICR小鼠對CA10病毒不敏感，21日齡ICR小鼠在感染大劑量病毒后仍能自愈。對于感染動物的排泄物進行檢測，在少數(shù)糞便樣本中檢測到少量病毒，載量約為2X102-103copies/mg；因此需對墊料等接觸動物糞便的物品按要求進行高壓滅菌處理。

動物感染病毒后取得的血液和組織直接放入核酸裂解液或組織固定液，滅活病毒。所有涉及到的相關(guān)污染物如離心管、注射器、手術(shù)剪、手術(shù)鑷和毒株等將統(tǒng)一高溫高壓消毒后集中處理。

動物實驗操作均在ABSL-2動物房的生物安全柜中進行，實驗后將病毒毒株、動物尸體、尿墊等包裝好進行高壓滅菌處理，注射器放入利器桶處理。

1. 動物癥狀觀察：

7日齡ICR小鼠感染CA10病毒4天后，出現(xiàn)不同程度的臨床癥狀，癥狀由輕到重包括：駝背或炸毛，后肢無力，單后肢癱瘓，雙后肢癱瘓，嚴重的直至死亡。感染后第5天，感染小鼠臨床癥狀評分超過4分（圖1A）；感染后第7天，感染小鼠全部死亡（圖1B）。相對于正常組小鼠，感染小鼠體重增加減緩，從感染第1天的5.57g增加到第6天的7.33g，而正常小鼠從5.64g增加到8.03g（圖1C）。

圖1. ICR7日齡乳鼠感染CA10病毒后癥狀觀察。A，感染后乳鼠的臨床癥狀評分時間變化曲線；B，感染后乳鼠的存活率時間變化曲線；C，感染后乳鼠體重隨時間變化曲線。

2. 血液和組織中病毒復(fù)制情況：

感染后第1天血液和肌肉組織中病毒載量都低于檢測閾值。到第3天血液中病毒載量到達高水平1.7X107 copies/μl，隨后血液中病毒載量下降至1.1X105copies/μl。后肢肌肉的病毒載量在感染后第3天和第5天都維持很高的水平，分別為2.9X107 copies/mg和6.1X107 copies/mg。

圖2. ICR7日齡乳鼠感染CA10病毒后血液和組織中病毒載量情況。A，感染后第3天和第5天血液中病毒載量情況； B，感染后第3天和第5天后肢肌肉組織中病毒載量情況。

動物模型評價方法

1. 臨床癥狀觀察：

動物感染CA10病毒后觀察10天，每天記錄體重變化、癥狀和死亡率。根據(jù)癥狀嚴重程度，參照以下標準低動物進行臨床評分打分：

0：未見異常；

1：駝背或炸毛；

2：后肢遲緩無力；

3：單后肢癱瘓；

4：雙后肢癱瘓；

5：死亡。

2. CA10病毒載量測定方法：實時熒光定量PCR技術(shù)-標準曲線法。

2.1取樣：分別在感染后第1天、第3天、第5天處死動物，采集血液100ul和后肢肌肉組織樣本50mg，放入Trizol中；

2.2 RNA提取：采用Trizol法提取血液和肌肉組織中的RNA；

2.3 一步法熒光定量PCR檢測病毒核酸濃度：

（1）特異性引物和Taqman探針：

Forwardprimer：GAAATGGRGTGTTGGAAACCA，

Reverseprimer：TTTCTGCGRAGTTGGACAAAG，

Probe:FAM-ATCAACCAYTTCTTCTCYCGCTCTGG-TAM；

（2）標準品：合成的CA10病毒核酸片段，濃度梯度為：2X109copies/μl、2X108copies/μl、2X107copies/μl、2X106copies/μl、2X105copies/μl、2X104copies/μl、2X103copies/μl、2X102copies/μl。共8個稀釋梯度，每個濃度做3個重復(fù)。

（3）陰性對照和陽性對照：陰性對照用水代替核酸樣本；陽性對照采用CA10病毒儲液提取得到的核酸；

（4）熒光定量PCR試劑盒：Qiagen RNeasy Mini Kit（貨號:74106），根據(jù)試劑盒要求準備反應(yīng)體系；

（5）反應(yīng)條件：①反轉(zhuǎn)過程：50℃ 30min；②PCR過程：95℃ 15min；94℃ 15s，60℃ 60s，該步驟循環(huán)數(shù)為40；

（6）實驗儀器：ABI Q3熒光定量PCR儀

（7）結(jié)果分析：

① 反應(yīng)結(jié)果應(yīng)同時符合以下條件，否則實驗結(jié)果無效。陰性對照：無擴增，為陰性。

② 標準曲線：標準曲線R2大于0.95可用，若低于0.95數(shù)據(jù)不可用，則需重新測定；

③ 結(jié)果判斷：根據(jù)標準曲線計算出CA10病毒的載量。病毒載量的檢測閾值為2X10^{2 copies/μl，低于該數(shù)值的結(jié)果不可信。}

評價指標體系：

1. 臨床癥狀評價：CA10病毒感染成功模型應(yīng)具有典型的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，即可觀察到動物的重癥肌無力表型，包括單后肢或雙后肢癱瘓，根據(jù)臨床評分標準感染CA10病毒5天后臨床癥狀可達到4-5分，死亡率在感染7天后可達到80%以上。

2. 血液和組織中病毒復(fù)制情況評價體系：動物在感染CA10病毒后第1天、第3天、第5天采集血液和后肢肌肉組織樣本，測定其中的病毒載量。經(jīng)腹腔注射感染后，第1天病毒載量都低于檢測閾值。CA10病毒首先在血液中復(fù)制達到較高水平，第3天的檢測值在106 copies/μl以上，而到第5天血液中病毒載量出現(xiàn)下降，檢測值在104 copies/μl-105 copies/μl；而在后肢肌肉組織中，CA10病毒載量由第3天的2.9X107 copies/mg上升到6.1X107 copies/mg，說明病毒在肌肉中發(fā)生了大量擴增，具有典型的嗜肌性，與臨床癥狀表現(xiàn)相吻合。

1. 病毒準備：CA10病毒(GenBank: MF688814.1)，由醫(yī)院咽拭子分離得到，在人橫紋肌瘤細胞（RD）中培養(yǎng)、擴增，并采用反復(fù)凍融法釋放病毒，離心富集病毒。具體操作如下：

RD細胞經(jīng)常規(guī)傳代培養(yǎng)接種到T75細胞培養(yǎng)瓶，感染前棄去原培養(yǎng)基，細胞用含2%雙抗的PBS 洗2遍，吸出PBS后加入無血清DMEM培養(yǎng)基。接種適量的CA10病毒后，置37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱孵育1-2h；加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。接種病毒后2-3d病變CPE達到+++～++++，將T75細胞瓶置封口袋中，-80℃超低溫冰箱凍化3次。然后將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，4℃，2000rpm離心20min，沉淀細胞碎片。吸取病毒上清，分裝后凍存，并測定病毒滴度TICD50。

2. 實驗動物：采用SPF級7日齡ICR小鼠乳鼠，母鼠自然哺乳，在ABSL-2實驗室獨立飼養(yǎng)。CA10動物模型建立實驗通過IACUC審核，符合動物實驗要求。

3. 病毒感染：根據(jù)預(yù)實驗確定的感染劑量，即104TCID50CA10病毒，將病毒經(jīng)腹腔注射感染小鼠，注射劑量為100μl。對照組注射同等量的RD細胞上清。

一、疾病概述

手足口病是由腸道病毒引起的傳染病，多發(fā)生于5歲以下兒童，表現(xiàn)口痛、厭食、低熱、手、足、口腔等部位出現(xiàn)小皰疹或小潰瘍，多數(shù)患兒一周左右自愈，少數(shù)患兒可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等并發(fā)癥。個別重癥患兒病情發(fā)展快，導(dǎo)致死亡。引發(fā)手足口病的腸道病毒有20多種（型），自2008年在新加坡的暴發(fā)流行，柯薩奇病毒A10型（CoxsackievirusA10，CA10）成為手足口病主要致病血清型之一，由其感染引起的手足口病爆發(fā)事件在法國、芬蘭、印度等國家和地區(qū)不斷被報道。2013年以前，中國多地區(qū)暴發(fā)流行的手足口病病原以EV71和CA16為主，CA6和CA10次之。2013年以后，CA10引起的手足口病比例逐漸上升，成為國內(nèi)手足口病感染的優(yōu)勢病原體之一。CA10共分為A～G的7個基因型。目前國內(nèi)外大多通過與周邊地區(qū)或其他國家的流行株進行核苷酸和氨基酸的同源性對比，來分析CA10的流行情況。在我國，CA10近年來在多地區(qū)流行的病毒株保持著較高的同源性，與其他國家的分離株之間的同源性距離較遠，具有地域分布特點以及一定的時間分布特點。CA10傳染性強、隱性感染比例大、傳播途徑復(fù)雜、傳播速度快，在短時間內(nèi)可造成較大范圍的流行，疫情控制難度大。

CA10病毒主要通過糞口途徑傳播，主要經(jīng)胃腸道進入機體內(nèi)。病毒在入侵的局部上皮細胞中完成增殖，然后病毒侵入局部淋巴組織中繼續(xù)增殖并釋放入血導(dǎo)致第一次病毒血癥。病毒隨血液傳播接觸到正常靶細胞。病毒表面的VP1蛋白與靶細胞表面特異性受體結(jié)合，完成吸附過程，其基因組RNA進入胞質(zhì)。之后，病毒以其正鏈RNA作為模板，合成互補的負鏈RNA，又以負鏈RNA為模板合成病毒正鏈RNA，從而得到大量病毒RNA，進入子代病毒顆粒組裝階段。通過轉(zhuǎn)錄、翻譯，復(fù)制出二代病毒，再次釋放入血形成第二次病毒血癥并引起臨床癥狀。目前有大量研究表明，手足口病患兒的細胞免疫出現(xiàn)紊亂，并且這種免疫紊亂在重癥與死亡病例中表現(xiàn)得更加嚴重。肺水腫被認為是感染的患兒中是最為嚴重的并發(fā)癥之一，腦干的損傷則被認為是導(dǎo)致肺水腫的重要因素。很多研究表明參與細胞免疫的諸多炎性因子，例如IL-1、IL-6、IL-10、IL-13、IFN-γ、TNF-α的增加、T細胞亞群CD3+CD4+，以及自然殺傷細胞（NK）等，與肺水腫的發(fā)生具有相關(guān)性。

CA10易感染5歲以下年齡的幼兒，潛伏期多為2-10天。CA10感染兒童多引起輕型手足口病，患兒往往無明顯的早期癥狀，大多數(shù)病人預(yù)后良好。臨床上，往往表現(xiàn)為多發(fā)的斑丘疹和（或）皰疹，最多見于手足口、臂及膝關(guān)節(jié)。典型皰疹通常突出皮膚表面，呈現(xiàn)黃豆粒大小，圓形或橢圓形，其內(nèi)液體混濁，常無疼痛和瘙癢感，約1周時間皰疹可自行消退，通常不留疤痕。病人或伴有發(fā)熱、流涕、咳嗽、食欲不振、惡心、嘔吐或腹瀉等癥狀，一般能自愈，無后遺癥。但少數(shù)兒童感染CA10后出現(xiàn)嚴重并發(fā)癥，如腦膜炎、腦炎、急性弛緩性麻痹和神經(jīng)呼吸綜合征等。隨著CA10流行程度的增加、重癥病例的出現(xiàn)，開發(fā)針對性的抗病毒藥物和疫苗成為當(dāng)務(wù)之急，而建立穩(wěn)定的CA10感染動物模型不僅是開發(fā)藥物和疫苗的關(guān)鍵點之一，也為研究病毒的感染機制和機體免疫反應(yīng)提供研究基礎(chǔ)。

二、模型背景

1、CA10病毒信息

CA10屬于小核糖核酸病毒科腸道病毒屬；病毒顆粒呈20面體立體對稱球形，直徑為23-30μm，無包膜和突起，裸露的核衣殼由核酸和蛋白質(zhì)組成。CA10基因組為單股正鏈RNA，全長約7.4 kb。CA10基因組兩端為保守的非編碼區(qū)，中間為一個獨立的連續(xù)的開放閱讀框架（ORF）。基因組的順序依次為5'端非編碼區(qū)，P1區(qū)、P2區(qū)、P3區(qū)和一段3'端非編碼區(qū)。CA10病毒可用RD細胞培養(yǎng)，在37℃培養(yǎng)，48-96h達到高峰，在宿主細胞漿內(nèi)增殖，迅速引起細胞病變，表現(xiàn)為細胞皺縮、變圓脫落，病毒顆粒破膜釋放。CA10的感染可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高低度的抗體，具有中和作用，能夠抵抗再次的感染。同時血清中的抗體與其他腸道病毒間存在嚴重的交叉免疫反應(yīng)。2013年以后，CA10引起的手足口病比例逐漸上升，成為國內(nèi)手足口病感染的優(yōu)勢病原體之一。

2、實驗動物背景信息

ICR小鼠毛色白化。適應(yīng)性強，體格健壯，繁殖力強，生長速度快，實驗重復(fù)性較好，雌鼠自發(fā)性畸胎瘤和管狀腺瘤發(fā)病率為0%-1%，用氨基甲酸乙酯誘發(fā)時，11-16天胚胎期畸胎瘤和管狀腺瘤發(fā)病率為5.9%，離乳個體管狀腺瘤和囊瘤發(fā)生率為30%,孕鼠為3%。是國際通用的封閉群小鼠。外周血項和骨髓細胞，具有較好的穩(wěn)定性，是良好的血液學(xué)實驗用動物。是進行手足口病原研究的理想動物。

3、研究背景

隨著CA10流行程度的增加、重癥病例的出現(xiàn)，開發(fā)針對性的抗病毒藥物和疫苗成為當(dāng)務(wù)之急，而建立穩(wěn)定的CA10感染動物模型不僅是開發(fā)藥物和疫苗的關(guān)鍵點之一，也為研究病毒的感染機制和機體免疫反應(yīng)提供基礎(chǔ)。

目前國內(nèi)的CA10病毒動物感染模型有泰山醫(yī)學(xué)院的史衛(wèi)峰教授課題組的ICR乳鼠感染模型，采用5日齡ICR乳鼠感染CA10細胞適應(yīng)株TA151R，感染劑量為1.5X103TCID50，感染途徑為肌肉注射（Protective Efficacies ofFormaldehyde-Inactivated Whole-Virus Vaccine and Antivirals in a Murine Modelof Coxsackievirus A10 Infection. Journal of Viology, 2017, Volume 91, Issue 13:e00333-17.）。