Galetin-7基因沉默小鼠模型

我們通過野生BALB/c 小鼠、galectin-7轉(zhuǎn)基因小鼠和galectin-7沉默小鼠進行的質(zhì)譜分析、Western bloting以及免疫共沉淀，我們發(fā)現(xiàn)Galectin-7與細胞骨架蛋白質(zhì)包括肌球蛋白輕鏈-3，肌鈣蛋白C，肌動蛋白-1，角蛋白-13和中間絲相關(guān)蛋白相互作用，并參與細胞凋亡調(diào)控。有關(guān)Galectin-7在哮喘中的作用未見國內(nèi)外報道，這些結(jié)果對于深入了解哮喘的發(fā)病機制有重要的意義，可用于哮喘的診斷和風險預測，并作為未來治療的靶點。

實驗動物制備后在屏障環(huán)境繁育，3-4月齡脫頸椎處死，取肺組織進行檢測。動物尸體統(tǒng)一放入冰柜處理。實驗動物使用通過了醫(yī)學實驗動物研究所倫理委員會批準（ILAS-PG-2014-010）

我們對該基因修飾小鼠進行質(zhì)譜分析，注：野生BALB/c小鼠（114#），galectin-7沉默小鼠（115#），galectin-7轉(zhuǎn)基因小鼠（116#）。差異倍數(shù)≥1.2或差異倍數(shù)≤0.833，所得結(jié)果進入分析。共篩選出1009個差異蛋白。兩兩比較，已知蛋白如下表。發(fā)現(xiàn)Galectin-7的相關(guān)蛋白：細胞骨架類：肌球蛋白輕鏈3（Myosinlight chain 3）、肌球蛋白（Myosin-1）、肌動蛋白（Actin1）、肌鈣蛋白C（TroponinC）、中間絲相關(guān)蛋白（Repetin）、角蛋白4（Keratin-4）,角蛋白13（Keratin-13）,肌集鈣蛋白（Calsequestrin）、肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ATP酶鈣（Sarcoplasmic/endoplasmicreticulum calcium ATPase）；物質(zhì)轉(zhuǎn)運：二磷酸甲羥戊酸脫羧酶（Diphosphomevalonatedecarboxylase）；急性時相蛋白：α1-酸性糖蛋白2（Alpha-1-acidglycoprotein 2）或血清淀粉樣蛋白A（Serumamyloid A protein）。

野生BALB/c小鼠（114#），galectin-7沉默小鼠（115#），galectin-7轉(zhuǎn)基因小鼠（116#）差異蛋白。

免疫共沉淀結(jié)果：發(fā)現(xiàn)在野生BALB/c小鼠，galectin-7轉(zhuǎn)基因小鼠和galectin-7干擾小鼠中都存在Galectin-7，且在3組間都發(fā)現(xiàn)Galectin-7與肌球蛋白輕鏈-3，肌鈣蛋白C，肌動蛋白-1，角蛋白-13和中間絲相關(guān)蛋白有相互作用。

野生BALB/c小鼠，galectin-7轉(zhuǎn)基因小鼠和galectin-7沉默小鼠中g(shù)actin-7相互關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)

注：野生BALB/c小鼠（陰性組），galectin-7轉(zhuǎn)基因小鼠（SPC組）和galectin-7干擾小鼠（Anti組）。

（1）將galectin-7CDNA序列輸入網(wǎng)上的基因沉默片斷選擇軟件，選擇沉默的發(fā)夾DNA。DEFINITION Mus musculus lectin, galactose binding,soluble 7 (Lgals7)CDNA

C A G C G A C T G G C CA C A T T G TGATGGAAAGGGAGGAGCTGAACCACTACCTTGCCTTTACTTAAGGTCCCCTCCCACAGCGACTGGCCACATTGTTGCTGTATTGCTGTGCCCGCCATGTCTGCTACCCAGCACAAGACCTCCCTGCCTCAGGGCGTCCGCGTGGGCACTGTCATGAGAATTCGAGGCATGGTCCCTGACCAGGCTGGCAGGTTCCATGTAAACCTGCTATGCGGTGAGGAGCAAGGAGCAGATGCCGCCTTGCACTTTAACCCGAGGCTGGACACTTCCGAGGTTGTCTTCAACACCAAAGAACAAGGCAAATGGGGCCGTGAGGAGCGAGGCACCGGCATCCCCTTCGAGCGTGGGCAGCCCTTTGAAGTGCTCCTCATCGCCACAGAGGAAGGCTTCAAGGCTGTGGTCGGGGATGACGAATATCTCCACTTCCACCACCGGATGCCGCCCGCGCGCGTGCGCTTGGTGGAGGTGGGCGGAGACGTGCAGCTGCATTCAGTGAAGATCTTCTAAGCAAGGACCCAAGGGCGTGGCGGGTAGGGGTGGGGGTGTAGGATCGCAGAGGAGGGTTTTGGATGGCGAATAAAGTGTAGCTGTAGTTCTG

（2）分別合成3個不同位置galectin-7CDNA的正義和反義發(fā)夾DNA。

（3）將正義和反義序列退火，并通過連接酶與基因沉默載體p-silencer5.1連接。

（4）通過酶切確定沉默載體構(gòu)建完成

（5）通過細胞培養(yǎng)和基因沉默載體轉(zhuǎn)染，檢測不同發(fā)夾的基因沉默效率

基因沉默效率細胞水平上的Western檢測

（6）選擇沉默效果高的發(fā)夾，通過核基因注射把p-silencer5.1中的啟動子和發(fā)夾基因轉(zhuǎn)入小鼠的核基因（7）首建鼠仔代基因鑒定，利用PCR引物鑒定發(fā)夾基因是否轉(zhuǎn)入。

基因沉默首建鼠PCR檢測

上游引物5’ATCCTCCCTTTATCCAGC 3’

下游引物 5’ GAGGGCCTATTTCCCATG 3’

退火溫度51度，產(chǎn)物大小392 BP

（8）首建鼠仔代Western Blot鑒定基因的沉默效果。

沉默鼠Western Blot檢測

一、疾病概述

眾所周知，哮喘等過敏性疾病都具有復雜的病因，是環(huán)境和遺傳共同作用的結(jié)果。長期外來刺激影響下，誘導患者某些基因的表達發(fā)生改變，引發(fā)支氣管上皮細胞異常損傷，然后出現(xiàn)細胞凋亡，最后導致氣道慢性炎癥和哮喘的發(fā)生[7-11]。這些外來刺激包括環(huán)境煙霧、大氣污染物、吸入變應原（如屋塵螨）、化學刺激物、病毒等。在相同的外界刺激下，如即使是在空氣嚴重污染的重工業(yè)城市，也是只有少部分人發(fā)展成為哮喘患者，這就說明個人的遺傳基礎(chǔ)，即內(nèi)因（哮喘易感性）是哮喘發(fā)生的關(guān)鍵因素。目前認為哮喘是一種有明顯家族聚集傾向的多基因遺傳性疾病，即哮喘的發(fā)生有患者的遺傳基礎(chǔ)。哮喘患者親屬發(fā)病率高于群體平均發(fā)病率。通過對比家族群間的遺傳差異可以篩選出哮喘易感候選基因，為哮喘的早期預防和治療提供依據(jù)。

二、模型背景

1、造模因素信息

半乳糖凝集素（galectin) 是凝集素超級家族中的一個家族，廣泛分布于各種活性有機體內(nèi)。已克隆并命名的成員有15個，結(jié)構(gòu)上都有1或2個糖識別域，對β半乳糖苷有特殊的親和力。半乳糖凝集素家族在細胞黏附、細胞凋亡、炎癥反應、腫瘤轉(zhuǎn)移等許多生理和病理過程中發(fā)揮重要的作用。半乳糖凝集素-7是由Madsen及其同事在研究維持人正常表皮細胞表型的標記時發(fā)現(xiàn)的。Galectin-7其相對分子量大小為14kD。Galectin-7還叫抑癌基因p53誘導基因1(P53-induced gene 1,PIG1)，主要表達在上皮細胞，特別是在復層上皮細胞，與細胞P53依賴性的凋亡，增殖，調(diào)控和分化有關(guān)。Francoise等的關(guān)于紫外線輻射（UVB）對表皮角質(zhì)形成細胞Galectin-7表達可能產(chǎn)生的影響的研究顯示UVB照射角質(zhì)形成細胞后，Galectin-7的 mRNA和蛋白表達量迅速增加。表明Galectin-7的過表達與曬傷或角質(zhì)形成細胞凋亡相關(guān)。曹等的研究表明Galectin-7在維持表皮穩(wěn)態(tài)過程中至關(guān)重要。Niiyama等的研究證明在皮膚屏障破壞后，如特應性皮炎（AD）、老年性干燥癥，表皮的角質(zhì)形成細胞中Galectin-7的表達增加。且隨著AD患者皮膚損傷程度的減輕，同時觀察到角質(zhì)層膠帶剝離標本中Galectin-7的值降低。因此他們把Galectin-7作為判斷皮膚狀況的生物標志物。綜上所述，Galectin-7是維持上皮穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵細胞因子，而且其高表達與上皮屏障受損直接相關(guān)。

2、實驗動物背景信息

BALB/c Mouse

3、研究背景

該動物模型的研究目的及意義；該動物模型的國內(nèi)外研究進展并附參考文獻。

目前哮喘的相關(guān)基因研究眾多。Jun Kanazawa等人對2組獨立的日本人群進行了候選基因關(guān)聯(lián)研究，發(fā)現(xiàn)鈣粘蛋白相關(guān)家族成員3（CDHR3）編碼區(qū)的SNP突變（rs6967330，Cys529 / Tyr）會增加呼吸道病毒感染的遺傳易感性，促進哮喘的發(fā)生[1]。Toll樣受體（Toll-likereceptor，TLR）是先天免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵部分。 TLR基因的變異與自身免疫性疾病，如過敏和哮喘有關(guān)。Petri Koponen等人分析了平均年齡為6.4歲的因支氣管炎住院的133名兒童的TLR基因在1rs5743618，TLR2rs5743708和TLR6rs5743810三個座位的單核苷酸多態(tài)性。他們研究首次證明了TLR1的rs5743618座位基因變異與幼童的細支氣管炎、哮喘以及濕疹的發(fā)生有關(guān) [2]。Yu Utsumi等人招募了182名日本哮喘患者，并對受試者進行rs20541座位基因型分析。他們的結(jié)果顯示IL-13基因rs20541位點的3組不同基因型的患者之間氣道高反應性、FEV1％的預測值以及FEF75％的預測值存在顯著差異，由此推測 IL-13基因中的rs20541多態(tài)性影響了該研究人群的氣道高反應性和肺功能 [3]。綜上所述，以上研究都證實了哮喘患者的遺傳異質(zhì)性[12]。

我們的前期研究已經(jīng)證實哮喘患兒與非哮喘健康對照兒童比較支氣管上皮細胞在呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）感染后，半乳糖凝集素-7（galectin-7）基因上調(diào)8倍[5]。孫麗華等人也發(fā)現(xiàn)哮喘組急性發(fā)作期和緩解期血清galectin-7水平顯著高于健康對照組[6]。但是哮喘的發(fā)生機制研究中還沒有關(guān)于galectin-7基因的報道。1995年Madsen及其同事在研究維持人正常表皮細胞表型的標記物時首次發(fā)現(xiàn)了半乳糖凝集素-7（galectin-7，GAL-7）[7]。Galectin-7還叫抑癌基因p53誘導基因1(P53-induced gene 1,PIG1)，主要表達在上皮細胞，特別是在復層上皮細胞，與細胞P53依賴性的凋亡，增殖，調(diào)控和分化有關(guān)。之后越來越多的研究發(fā)現(xiàn)galectin-7不僅影響腫瘤的發(fā)生，發(fā)展，在生理發(fā)育、免疫、炎癥和代謝方面也有重要作用[8-15]。我們制作基因galectin-7沉默模型和該基因高表達模型，人為將該基因的表達提高或降低，從而探索該基因的表達水平的變化對氣道屏障的作用及其與哮喘發(fā)生的關(guān)系。

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