PON1基因敲除大鼠模型

國際上此前雖然有過PON1基因敲除小鼠的研究報道，但只是聚焦于PON1基因敲除提高巨噬細胞的氧化應激和動脈粥樣硬化疾病相關的研究[19]，沒有敲除大鼠以及免疫調節的相關報道。目前，僅有我們首次報道了PON1基因敲除大鼠的建立以及有關免疫T細胞發育受損的研究，以及關于PON1基因敲除大鼠腦部小膠質細胞異常活化的最新的研究成果[20]，因此PON1基因敲除大鼠模型的建立以及利用該動物模型開展的神經系統炎癥表型研究和分子機制研究，為免疫學和神經炎癥研究提供了工具動物模型支撐。大鼠資源詳見（SD.Pon1(tm)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）

模型制作及動物實驗中涉及動物的操作程序已獲得中國醫學科學院醫學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準，批準號為ZLF18002和ZLF18003。本實驗部分使用了基因修飾動物（基因敲除），如果動物逃逸，將會造成的環境潛在的基因污染。實驗動物飼養繁殖于三樓動物房屏障環境中，整個實驗過程中保證動物處于監管狀態，無逃脫可能。動物房出入口安放擋鼠板，嚴防動物逃逸，定期對門窗進行檢查，保證嚴密，動物籠具一經發現破損，立即更換，飼養人員出入確保動物房門關緊并鎖住等。含重組DNA的廢棄核酸樣品、離心管、槍頭等用1M NaOH溶液浸泡后，裝入密封袋中，統一送到化學廢棄物處理公司處理。

1.PON1基因敲除大鼠的蛋白表達鑒定。

1.1 PON1蛋白在基因敲除大鼠的腦組織和小膠質細胞中表達缺失。

圖2 PON1在腦和小膠質細胞中的蛋白表達水平鑒定

1.2 PON1蛋白在基因敲除大鼠的胸腺組織表達缺失。

圖3 PON1在脾和胸腺免疫器官中的蛋白表達水平鑒定

1.3 PON1敲除降低LPS誘導致死率。

圖4 PON1敲除大鼠和野生型大鼠LPS實驗中的生存率分析

1.4 PON1 敲除降低LPS誘導后血清中的TNF-α水平。

圖5 PON1敲除大鼠和野生型大鼠LPS實驗血清的ELISA分析

1.5 PON1敲除誘導小膠質細胞向M2型轉化。

圖6 PON1敲除大鼠和野生型大鼠神經小膠質細胞免疫組化分析

1.6 PON1 基因敲除可使小膠質細胞產生抑炎、促吞噬的表型。

1.6.1 PON1敲除大鼠小膠質細胞吞噬功能增強

圖7 PON1對小膠質細胞吞噬功能的調節

1.6.2 PON1 敲除降低LPS誘導的促炎性細胞因子分泌

圖8 利用Luminex 和ELISA方法檢測細胞上清中細胞因子的分泌水平。

1.6.3 PON1敲除導致胸腺變小，胸腺細胞減少

圖9 PON1敲除大鼠和野生型大鼠胸腺細胞對比分析

1. 實驗材料

1.1實驗動物

SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司和北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.2主要實驗儀器

Nikon顯微注射儀

Nikon光學顯微鏡

BIO-RAD電泳儀

Tanon電泳槽

Tanon數碼凝膠圖像處理系統

Incucell恒溫培養箱溫控

TAITEC振蕩箱

Eppendorf離心機

Eppendorf移液器

2.實驗操作規程和動物處理倫理

模型制作中涉及動物的操作程序已獲得中國醫學科學院醫學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準，批準號為ZLF18003，簡要步驟如下：

2.1 供卵雌鼠超排

實驗第一天8：00腹腔注射PMSG30IU/只(0.6ml／只)，46～48h以后，實驗第三天10：00腹腔注射HCG30IU/只(0.6ml／只)，注射HCG后立即與與種鼠1：1合籠。實驗第四天8：00～9：00檢查陰道栓，有陰道栓的大鼠在大鼠標牌上注明日期和⊕（陽性），撿出有陰栓的大鼠進行受精卵的收集。

2.2 受精卵的收集

2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，脫頸處死，解剖大鼠，找到卵巢，輸卵管和子宮，將卵取出，用透明質酸酶消除胚泡的黏著，使卵分離。在移換到另外的培養液中，要將透明質酸酶充分洗凈（洗約3~5次）。

2.3 向受精卵雄性原核注入DNA溶液

2.4. 僅將未損壞的完成操作的卵收集起來，移植到假妊娠大鼠輸卵管中。術后將大鼠置于安靜的環境下飼養。

2.5 基因表型鑒定

在判定有導入基因大鼠之后，立即將基因修飾大鼠另行飼養，對不用的大鼠進行處理。陰性大鼠的處理：（1）留和陽性大鼠等量的陰性大鼠對照。（2）剩余的陰性大鼠用于其它符合動物倫理的其他實驗室的實驗（保存記錄）。

3. PON1基因敲除靶點設計與測序鑒定

利用CRISPR/Cas9技術建立基因敲除大鼠，sgRNA 的作用靶點位于第四外顯子。通過顯微注射成功獲得敲除大鼠，其中首建鼠F0（#20）敲除片段大小為342bp，能夠穩定傳代。PON1 雜合子大鼠之間雜交得到同窩陰性對照大鼠和敲除純合子用于實驗研究。大鼠模型資源詳見（SD.Pon1(tm)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）

圖1 PON1基因敲除設計策略

一、疾病概述

我們的模型研究結果證實PON1敲除損傷免疫T細胞的發育，并顯著調節神經免疫細胞——小膠質細胞的極化，之前的文獻報道揭示了PON1參與抑制單核-巨噬細胞的分化，均提示PON1可作為一種新的免疫調節因子。該動物模型涉及到小膠質細胞相關的炎癥反應和T細胞發育兩方面，分述如下：

小膠質細胞是腦內常駐的免疫細胞，數量約占人腦細胞總數的0.5-16.6%，又稱腦內的巨噬細胞，構成中樞神經系統的第一道防線。生理狀態下的小膠質細胞處于相對的靜息狀態，因此被稱為靜息型小膠質細胞(resting microglia)。靜息型小膠質細胞在發育的神經系統中起著調控神經元存活和修飾突觸的作用，并且在成熟的健康腦中具有探測和調控神經元活動的功能；在炎癥刺激病理狀態下，包括在腦損傷、病原入侵以及退行性疾病中，小膠質細胞首先啟動，遷移至損傷部位，轉化為激活狀態，呈現阿米巴蟲樣的典型巨噬細胞形態，因此被稱為阿米巴樣小膠質細胞(amoebic microglia)。小膠質細胞激活大體分為M1經典激活型和M2選擇激活型。M1型為促炎狀態，小膠質細胞釋放大量的促炎性細胞因子如腫瘤壞死因子α、白介素1β、白介素6或白介素12，這些炎性因子會對神經細胞產生毒性作用, 嚴重的會致使神經細胞凋亡；M2型為抗炎狀態，能夠釋放抗炎性細胞因子如白介素4、白介素13，吞噬損傷的神經細胞碎片、促進組織修復和神經元的再生。

神經炎癥反應是許多神經退行性病變的重要病理基礎，在神經系統創傷后的神經退變中也發揮重要作用。小膠質細胞通過吞噬作用清除細胞碎片，并釋放神經生長及抗炎因子而減輕神經損傷，促進組織修復。然而很明顯，小膠質細胞高度活化狀態可釋放高水平的促炎因子及細胞毒性物質，從而造成神經元失能及細胞死亡。神經系統損傷后，活化的小膠質細胞及浸潤的巨噬細胞具有異質性。

胸腺是機體的重要免疫器官，由皮質和髓質兩部分組成，主要包括胸腺上皮細胞和T淋巴細胞。T淋巴細胞(T細胞)是淋巴細胞的一種,在免疫反應中扮演著重要的角色。T細胞在胸腺中發育經歷CD4-CD8-(Double negative,DN)、CD4+CD8+(Double positive,DP)及CD4+或CD8+(Singlepositive,SP)三個主要階段,最后進入外周淋巴組織。胸腺病變將對機體免疫功能帶來嚴重影響，使機體免疫自穩功能紊亂并伴發自身免疫性疾病。但是，目前對于胸腺發育和T淋巴細胞產生的分子機制仍不清楚。

二、模型背景

1、PON1信息

人類的對氧磷酶家族包括3個成員即PON1、PON2 和PON3，其中PON1是由354 個氨基酸組成的相對分子質量約為43000～47000的糖蛋白。目前的研究表明，PON1 主要由肝臟合成，大部分結合在肝臟細胞內微粒體上，在人體廣泛分布于肝臟、血液、腎臟、脾臟、腸及腦，其中在肝臟和血液中活力最高。PON1 在血液中借助于疏水的N 端和載脂蛋白AI 緊密結合，固定于高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)顆粒上。PON1 因能水解對氧磷而命名為對氧磷酶，實際上PON1 是一個可以水解多種內源或外源物質的、多功能的水解酶，其底物可歸為芳香類和內脂類二類。PON1 參與脂代謝、藥物代謝和毒物代謝等多種病理和生理過程。與心腦血管病，糖尿病、惡性腫瘤、自身免疫性疾病和神經退行性疾病等多種疾病有關。

2、實驗動物背景信息

SD大鼠

3、研究背景

該動物模型的研究目的及意義；該動物模型的國內外研究進展并附參考文獻。

3.1該動物模型的研究目的及意義

對氧磷酶1（paraoxonase 1, PON1）是AD 的風險基因，PON1 與AD 的關系目前停留在流行病調研水平，機制研究尚未見報道。PON1 是否也通過抗氧化或抗炎癥作用抵抗AD 的發生發展，機制如何，仍有待開展更多研究工作加以論證。PON1基因敲除大鼠可以用于研究PON1功能缺失對于免疫功能的影響。

更深入地講，小膠質細胞的吞噬作用是阿爾茨海默病中Aβ清除的主要途徑之一。TREM2已經成為近五年國內外AD 研究前沿熱點和潛在治療靶點之一。TREM2 可調控小膠質細胞由M1 型（神經損傷）向M2 型（神經保護）轉變，是調控小膠質細胞活化狀態的重要信號蛋白[1]。最新證據顯示，在小鼠模型中TREM2 除了能減少與AD 相關的病理，還能夠緩解認知功能上的缺陷[2, 3]。這提示使用大腦現有的免疫機制來清除淀粉樣蛋白可以作為一種治療AD 的新策略，可通過上調TREM2 的表達或激活TREM2 信號通路實現。我們的研究發現PON1與TREM2之間存在互作關系，我們利用PON1基因敲除大鼠，展開研究將深化對這一腦內免疫機制的理解。

3.2 國內外研究進展

在過去20年，PON1的研究主要集中在心腦血管病方面，一是PON1多態性與粥樣硬化、冠心病、腦梗死等的相關性[4, 5]；二是PON1 在血漿中的水平作為心腦血管病預警標志物研究。在PON1 分子機制方面反而沒有大的進展，僅僅報道了PON1在脂代謝和血管疾病中的可能發揮抗炎和抗氧化作用[6-10]。

迄今，PON1 與AD 等神經退行性疾病的關系目前停留在流行病調研水平，研究認為PON1的多態性是AD或PD的危險因子或某些多態性攜帶者對環境致病因素更敏感[11-16]，血漿中的PON1 低活性也是AD 的危險因素[17, 18]，因此PON1是AD和PD的風險基因，然而，PON1參與AD的分子機制研究尚未見報道。

國際上此前雖然有過PON1基因敲除小鼠的研究報道，但只是聚焦于PON1基因敲除提高巨噬細胞的氧化應激和動脈粥樣硬化疾病相關的研究[19]，沒有PON1基因敲除大鼠及調節免疫的相關報道。目前，僅有我們首次報道了PON1基因敲除大鼠的建立以及有關免疫T細胞發育受損的研究，以及關于PON1基因敲除大鼠腦部小膠質細胞異常活化的最新的研究成果[20]，因此PON1基因敲除大鼠模型的建立以及利用該動物模型開展的神經系統炎癥表型研究和分子機制研究，為AD和神經系統研究提供了工具動物模型支撐。

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