先天性小兒畸形Foxi3敲除小鼠模型

該模型通過埋植雌激素，進(jìn)而建立了皮膚型狼瘡動(dòng)物模型，主要是檢測(cè)其dsDNA，腎臟變化，結(jié)合皮膚癥狀變化，來確定狼瘡皮膚病模型的建立。目前國際上尚欠缺類似模型，創(chuàng)新點(diǎn)在于該模型可快速建立模型，屬于誘導(dǎo)性狼瘡皮膚病模型，為研究狼瘡皮膚病發(fā)病機(jī)制提供了工具。目前國際無報(bào)道。

無安全性問題。

foxi3敲除小鼠純合子胚胎有耳部畸形表型，外耳明顯小于正常，失去正常小鼠耳廓亞結(jié)構(gòu)形態(tài), 外耳道未見，其耳廓形態(tài)與人先天性小耳畸形比較類似。

利用Cre/loxP重組系統(tǒng)的原理，進(jìn)行基因敲除（knockout，KO），制備FOXI3敲除小鼠。小鼠的背景品系是C57BL/6。

(一)設(shè)計(jì)方案：

Foxi3forkhead box I3 [Mus musculus(house mouse) ]

Gene ID: 232077

Location: 6; 6 C1

Exon count: 2

（二）根據(jù)基因信息選擇靶點(diǎn)，合成sgRNA

targeting site 1:

tcccaggtataagagacg cgg

M-FOXI3-sgRNA-UP15’TAGGtcccaggtataagagacg

M-FOXI3-sgRNA-DOWN15’aaacCGTCTCTTATACCTGGGA

targeting site 2:

atcgctcctcagacttga tgg

M-FOXI3-sgRNA-UP25’TAGGatcgctcctcagacttga

M-FOXI3-sgRNA-DOWN25’aaacTCAAGTCTGAGGAGCGAT

(三)顯微注射

1，超數(shù)排卵：15只3-4周齡C57雌鼠注射激素進(jìn)行超排。

2，受精卵注射：取約150枚受精卵進(jìn)行注射。

3，雄鼠結(jié)扎：制作30只8周齡輸精管結(jié)扎的ICR雄鼠。

4，受體鼠制備：8-10周齡ICR與結(jié)扎的ICR雄鼠交配后選取見栓的雌鼠。

5，胚胎移植：將注射后的受精卵移植到受體鼠輸卵管壺腹部（移植一次， 150枚卵，5只受體鼠）。

(四)顯微注射基因型鑒定

1，剪尾編號(hào)：出生7-10天的乳鼠，剪取腳趾和尾尖進(jìn)行編號(hào)及取材。

2，基因組DNA提取： 使用全式金（Transgen）公司的基因組DNA提取試劑盒（EE101-12）提取基因組DNA

3，PCR檢測(cè)：根據(jù)序列信息設(shè)計(jì)檢測(cè)引物（上海英濰捷基）

M-FOXI3-ko-s 5’CAAATAAGTAGTCAATCCACTCAAACG 61.4℃

M-FOXI3-ko-a 5’TCCCACCCTTAACTCCAATGAC 62.3℃

M-FOXI3-wT-s 5’GGGCTGATTGATCTCTGAGTTC 60.2℃

M-FOXI3-wT-A5’AGGTGCTGAGGAAAGTGTTGAG 60.8℃

M-FOXI3-ko-s&A: TM=61℃ KO 603bp

M-FOXI3-wt-s&A: TM=60℃ WT 496bp

PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序（TaKaRaRR042A）

l反應(yīng)體系：

10×LA PCR BufferⅡ(Mg2+ Plus)

2.0 μl

dNTP Mixture(2.5 μM)

1.6 μl

引物-S（50 μM ）

0.2 μl

引物-A（50 μM ）

0.2 μl

模板DNA

2.0 μl

LA Taq

0.2 μl

補(bǔ)加ddH2O至總體積

20.0 μl

l擴(kuò)增程序：

l 6×loadingbuffer 終止反應(yīng)。

l 用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。

小耳畸形的病因目前還不完全明確，環(huán)境和遺傳因素是目前小耳畸形病因研究的重點(diǎn)。先天性小耳畸形在基因突變致病性研究方面還沒有闡明小耳畸形胚胎發(fā)育的機(jī)制。小耳畸形主要涉及胚胎發(fā)育期間第一和第二鰓弓的異常，主要表型涉及外耳發(fā)育異常。外耳的耳廓是由第一和第二鰓弓的逐漸融合形成的，在發(fā)育過程中第一和第二鰓弓之間是相互作用，兩弓之間的凹槽加深，形成外耳道，從胚胎的起源來分析，外耳的發(fā)育至少在一定程度上是由第一和第二鰓弓通過后腦的部分區(qū)域來介導(dǎo)的，后腦是鰓弓的神經(jīng)嵴細(xì)胞的來源，在后腦的第四段基因突變可以導(dǎo)致外耳的發(fā)育缺陷。

小耳畸形主要是指外耳的先天發(fā)育性結(jié)構(gòu)異常，其嚴(yán)重程度主要表現(xiàn)為從輕度結(jié)構(gòu)異常到完全性耳廓缺失，并且可伴有外耳道狹窄和外耳道閉鎖等一系列先天性外耳異常，輕者耳廓略小于正常， 畸形嚴(yán)重者耳廓全部消失， 絕大多數(shù)患者僅遺留花生狀或貝殼狀的殘耳組織。同時(shí)一些小耳畸形患者也常合并顱面部畸形，中耳及半側(cè)顏面骨及軟組織發(fā)育不良等。

FOXI3是轉(zhuǎn)錄因子Fox家族成員之一。受FOXI3調(diào)控的信號(hào)通路和基因很多，包括FGF、BMP、WNT等信號(hào)途徑及在胚胎發(fā)育過程中有重要作用的SIX、EYA和PAX等轉(zhuǎn)錄因子。研究顯示Foxi3敲除小鼠可檢測(cè)到Fgf3/8、Wnt8a、Eya1、Six1等基因表達(dá)異常；Foxi3敲除雞可檢測(cè)到Fgf2/3/19、Dlx5、Six1和Eya1等基因表達(dá)異常。Pax-Six-Eya-Dach是控制動(dòng)物眼、耳、腦神經(jīng)和肌肉發(fā)生及發(fā)育的關(guān)鍵基因網(wǎng)絡(luò)。在斑馬魚和雞Foxi3敲除的模型胚胎中也檢測(cè)到類似人OAVS患者的表型。在人的樣本中，也有Tassano E等報(bào)道了1例具OAVS表型的女孩被鑒定到包含F(xiàn)OXI3基因在內(nèi)的2.5Mb大小的染色體雜合缺失。