腸道病毒71型BALB/c小鼠模型

采用病毒滴度為104.5 TCID50/ml的EV71（NX10-147）經腹腔注射感染9日齡BALB/c乳鼠，建立重癥小鼠模型，6 dpi重癥模型小鼠發生后肢癱瘓最終導致死亡；繪制生存率（圖1A），體重增長曲線（圖1B），臨床評分（圖1C）。重癥小鼠模型在5 dpi時，2/7(28.57%)小鼠發生后肢癱瘓（圖2），在7 dpi時，4/7(57.14%)小鼠表現癱瘓，其體重也下降，11~12 dpi重癥小鼠出現死亡，生存率為71.43%(5/7)，其中存活的小鼠中60%(3/5)出現癱瘓后遺癥。

1.重癥小鼠模型各組織病毒載量檢測

為了進一步探討重癥EV71小鼠模型體內病毒載量情況，采用RT-PCR對3 dpi和5 dpi重癥小鼠腦、脊髓、骨骼肌、空腸和肺組織進行病毒核酸檢測（圖3），發現以上各組織在3 dpi和5 dpi 均檢測到EV71病毒，其中，檢測到重癥模型3 dpi骨骼肌中的高病毒載量（107.0 copies/mg），其中，3 dpi 在重癥模型腦組織中均檢測到低病毒載量(102.0 copies/mg)，5 dpi腦組織中病毒載量增加到104.0 copies/mg，說明5 dpi EV71病毒造成中樞神經系統感染加重。3 dpi在重癥模型脊髓、空腸和肺組織中的病毒載量104.0 copies/mg，5 dpi 病毒載量無明顯變化，重癥小鼠模型中均檢測到骨骼肌和脊髓中較高的病毒載量，說明這些組織是病毒復制并傳播到腦組織的重要部位。

2.重癥小鼠模型組織病理學變化

運用組織病理學和免疫組織化學技術，對重癥小鼠模型的各組織器官進行病理學觀察?？瞻讓φ战M小鼠未見明顯病理變化，并且EV71抗原呈陰性反應。

對重癥小鼠模型（NX10-147）進行組織病理學觀察（圖4），發現3 dpi和5 dpi 小鼠后肢骨骼肌發生嚴重的壞死性肌炎，肌纖維斷裂，大量炎性細胞浸潤，主要有淋巴細胞、嗜中性粒細胞、巨噬細胞；3 dpi 小鼠脊髓和腦干發生細胞源性水腫，神經元發生變性，偶見壞死，5 dpi小鼠脊髓前角運動神經元變性壞死，出現紅色神經元，并可見衛星現象和嗜神經現象，腦干組織中的神經元發生不同程度的變性壞死，并且可見腦干和脊髓神經元中的尼氏小體消失；5 dpi肺臟發生大面積間質性肺炎，間質增寬，炎性細胞浸潤，肺泡間隔毛細血管淤血，3 dpi和5 dpi肺臟發生局灶性肺氣腫；3 dpi和5 dpi空腸黏膜上皮細胞發生大面積空泡變性。免疫組織化學檢測發現在上述嚴重病變的組織中可觀察到EV71特異性抗原分布（圖5），在3dpi和5 dpi時，脊髓、腦干、空腸和骨骼肌檢測到較強的陽性EV71抗原信號，提示在這些組織中病毒復制活躍，然而在5 dpi時，肺臟檢測到中等強度陽性EV71抗原信號。

3.重癥小鼠模型血清細胞因子檢測

對重癥小鼠模型進行血清細胞因子檢測從血清細胞因子方面揭示重癥發生機制。本研究采用CBA方法檢測了重癥小鼠的3、6、12 hpi 以及1、2、3、5、7、9 dpi的血清細胞因子IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、TNF-α、IFN-γ，以及MCP-1、CCL5/RANTES的動態變化（圖6）。結果發現，這些血清因子中，IL-5、IL-13、IL-6、MCP-1、CCL5、TNF-α在重癥小鼠中發生某時間點的爆發性濃度增高，與空白對照組小鼠血清因子相比，發現重癥小鼠血清爆發性增高的細胞因子分別是3 hpi重癥IL-5上調4倍；48 hpi重癥IL-13上調1.2倍；3 dpi重癥IL-6、MCP-1都上調100倍以上；3 dpi和7 dpi重癥CCL5/RANTES分別上調9倍和10倍；重癥小鼠模型中的IFN-γ在5 dpi時達到峰值，重癥為10倍；7 dpi重癥TNF-α和MCP-1分別上調4倍和87倍。以上數據說明，IL-5和IL-13可能是EV71小鼠實驗感染早期炎癥反應的主要因素，并且細胞因子IL-6、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、CCL5/RANTES在重癥EV71實驗感染的免疫病理損傷中發揮重要作用。

4. EV71重癥小鼠模型的氣道阻力和血氣分析

對小鼠的氣道阻力進行分析，發現小鼠的吸氣時間延長，呼吸頻率降低，分鐘通氣量顯著降低（圖7），符合限制性通氣不足的特征，可能是小鼠死亡的主要原因之一。

采用血氣分析方法對EV71重癥小鼠模型組和對照組小鼠的呼吸效果進行分析，與對照組相比，4 dpi感染組小鼠的氧分壓（PO2）和氧飽和度（sO2）均明顯下降，PO2 由62.2 mmHg下降到 46.75 mmHg，差異極顯著（p < 0.01）（圖8A）；sO2由90.6 %下降到76.5 %，差異極顯著（p< 0.01）（圖8B），PO2和sO2的變化提示EV71重癥模型組小鼠處于缺氧狀態。并且發現二氧化碳分壓（PCO2）和二氧化碳總量（TCO2）有所上升，PCO2由27.22 mmHg增加到46.25 mmHg，差異顯著（p< 0.05）（圖8D）；TCO2由24.00 mmol/L 增加到25.75 mmol/L（圖8E），PCO2的變化提示EV71重癥模型組小鼠肺通氣效果可能存在障礙。進一步發現了血液酸堿度pH值和細胞外液堿剩余（BEecf）均明顯下降，pH值由7.42下降到7.33，差異顯著（p< 0.05）（圖8C）；BEecf由1 mmol/L降低到–2.25 mmol/L，差異顯著（p < 0.05）（圖8F），提示重癥模型組小鼠可能處于呼吸性酸中毒的狀態。以上血氣結果結合肺臟組織病理變化，說明EV71重癥模型組小鼠肺臟通氣功能低下，處于缺氧和呼吸性酸中毒的病理狀態。

5. EV71小鼠模型超微病理學變化

對照組小鼠肌肉組織可見橫紋明顯，每條肌原纖維都可見清晰明帶和暗帶交替排列，肌質內含有豐富的線粒體、肌原纖維、高爾基復合體、溶酶體、糖原顆粒等肌漿內含物，糖原顆粒散在分布于肌原纖維間和肌漿中（圖9A），肌細胞內可見清晰的線粒體，或在肌纖維間排列，其內外膜和嵴突結構清晰可見（圖9B）。感染組小鼠肌肉組織超微病變明顯，表現為肌組織橫紋消失，明暗帶模糊甚至消失，肌組織發生退行性變，細胞內出現水腫，部分肌原纖維發生溶解，肌質中的胞漿內容物減少，糖原顆粒甚至消失（圖9C）；線粒體腫脹、空化，基質電子密度降低，內室腫脹，嵴和膜結構模糊，嵴突變短減少，崩解消失，形成灶性空化；骨骼肌細胞核固縮，染色質邊集，異染色質明顯增多，發生變性、壞死。并且在肌纖維間可見巨噬細胞、中性粒細胞等炎性細胞浸潤。

對照組腦組織中神經元胞漿中的細胞器豐富，內質網發達，平行或不規則排列，其間游離存在核糖體（圖10A）；線粒體豐富，散布于整個胞體中，線粒體內外膜和嵴突結構清晰（圖10B）；腦組織中有髓神經纖維髓鞘電子密度均勻（圖10C）。感染組腦組織超微病變輕微，神經元細胞器豐富，內質網發達，線粒體豐富；神經元胞漿中可見少量空泡，部分線粒體內室腫脹(圖10E)；有髓神經纖維髓鞘發生層面分離，導致小泡性分離，呈現泡狀改變（圖10F）。

對照組脊髓前角神經元常染色質明顯，異染色質少，細胞器豐富（圖11A）；脊髓前角神經元胞質中線粒體豐富，內質網發達（圖11B）。感染組脊髓前角神經元中粗面內質網擴張，出現尼氏小體溶解，核周見微空泡形成；胞核皺縮，異染色質增多，細胞器減少，粗面內質網和高爾基復合體呈現不同程度的擴張，細胞質呈篩狀外觀，并伴隨不同程度的多聚核糖體丟失，導致粗面內質網脫顆粒；線粒體腫脹，線粒體嵴突腫脹，嵴數量減少（圖11C）。小膠質細胞包圍吞噬神經元細胞，呈現嗜神經現象（圖11D）。

對照組肺組織中I型上皮細胞扁平，其細胞核內可見呈淺亮的常染色質和呈深色顆粒狀的異染色質，胞質少而薄，胞漿內可見少量細胞器，與周圍細胞連接緊密（圖12A）；肺組織中的II型上皮細胞核大而圓，常染色質細密，異染色質少，粗面內質網、高爾基復合體、溶酶體等細胞器豐富（圖12B）；II型上皮細胞胞漿中可見清晰的特征性包含物——嗜鋨性板層小體（圖12C）。感染組肺組織中I型上皮細胞核中染色質邊集，呈不規則堆積，并且與周圍細胞之間連接松弛（圖12D）；肺組織中II型上皮細胞核形狀不規則，染色質邊集，核周細胞質電子密度降低，粗面內質網、核糖體、高爾基復合體等細胞器減少，胞質出現細小空泡變，嗜鋨性板層小體或出現排空現象，溶酶體增多（圖12F）；肺泡壁中的細胞成分增多，其中肺泡II型上皮細胞增生，發生了間質性肺炎。

H1PV為低于人間傳染病名錄三級安全風險的病原，人類感染風險低。

H1PV是大鼠必須排除的病原體，對動物有致病性。會干擾其他實驗研究。

鑒于此，此感染實驗必須在BSL-2級以上的生物安全實驗室進行病原學實驗，在ABSL-2實驗室進行動物實驗。

重癥EV71小鼠模型臨床癥狀可隨著感染時間增加，表現為豎毛、后肢癱瘓，甚至死亡。

2.1 病毒培養

2.1.1 細胞株

橫紋肌瘤細胞（RD）。

2.1.2 實驗動物

SPF級9日齡BALB/c乳鼠，每窩5 ~ 7只，母鼠自然哺乳。

2.1.3 病毒

EV71臨床分離株基本信息見表1。

表1. EV71臨床分離株基本信息

2.1.4 病毒培養與病毒TCID50的測定

RD細胞貼壁覆蓋細胞培養瓶生長成單層后，分別接種EV71病毒株，24 hpi觀察細胞形態，待90%的細胞發生細胞病變時，將細胞培養瓶置于–80℃冰箱中，并反復凍融3次后，經離心后分裝病毒液并低溫保存。采用常規方法測定TCID50。在BSL-2實驗室中進行實驗。

2.2重癥EV71小鼠模型建立

根據前期預實驗結果確定攻毒量，建立重癥EV71小鼠模型，9日齡BALB/c乳鼠輕度麻醉后，經腹腔注射104.5 TCID50臨床分離株NX10-147(GenBank登錄號KJ004556)，攻毒劑量為250 μl/只；空白對照組乳鼠(n=12)腹腔注射等量RD細胞上清，其中3只取其血清作為對照組血清。分別在3、6、12 hpi 和1、2、3、5、7、9 dpi采集每組各3只乳鼠血清以備檢測血清中的細胞因子。在3 dpi和5 dpi每組各剖殺3只乳鼠，立即取其腦干、脊髓、肺臟、后肢骨骼肌和空腸固定在4 %多聚甲醛中，以備組織病理學檢測；同時，每組另剖殺3只乳鼠取以上組織凍存，以備病毒RNA提取和組織內病毒載量測定。

手足口?。╤and, foot, and mouth disease, HFMD）是由腸道病毒引起的，以發熱和手、足、口腔、臀部等部位出現皮疹、皰疹或皰疹性咽峽炎為主要特征的一種常見于小兒的急性傳染病。手足口病多發生于入學前兒童，尤其是3歲以內的嬰幼兒，少數患者會發展為重癥，并發無菌性腦膜炎、腦干腦炎、神經源性肺水腫、急性弛緩性麻痹和心肌炎等，死亡率和致殘率較高。腸道病毒71型（enterovirus71, EV71）是導致手足口病暴發的主要病原體，是一種高度嗜神經病毒，易導致神經系統感染，發展成重癥，對重癥死亡患者尸檢表明腦干是其最易感染的部位，因此，重癥手足口病患者表現出嚴重的神經系統并發癥，以及肺出血、循環障礙、心臟損害等。

EV71感染主要引起患者發生手足口病，臨床表現與柯薩奇病毒等其他腸道病毒感染引起的手足口病難以區別，但EV71感染還能引起無菌性腦膜炎、腦干腦炎、脊髓灰質炎樣麻痹、神經源性肺水腫和心功能衰竭等嚴重神經系統疾病和并發癥。

EV71主要通過糞口途徑傳播，最初EV71病毒定植于鼻咽部或胃腸局部黏膜，侵入淋巴組織并在其中繁殖，并引起第一次病毒血癥，若機體免疫力差，則EV71可擴散入侵全身網狀內皮組織、深層淋巴結、肝、脾、骨髓等組織器官，大量繁殖后再次入血，引起第二次病毒血癥，EV71最終可侵入靶器官細胞，如腦、腦膜、脊髓、心肌、橫紋肌以及皮膚黏膜等組織，引起重癥病變，導致中樞神經系統的嚴重損害。對手足口病重癥死亡病例進行尸體剖檢，發現腦組織尤其是腦干中的病變最為嚴重，表現為神經元壞死、腦軟化、嗜神經現象、膠質結節和血管袖套等病毒性腦炎的病理改變，這與腸道病毒的神經嗜性相符。一般認為間腦、中腦、腦橋、延髓是主要的病理靶區。EV71感染患者血清和腦脊液中有高水平的IL-1β、IL-6、IL-10、IL-13、IFN-γ、TNF-α等細胞因子表達。重癥EV71感染還可引起嚴重的心血管并發癥，導致嚴重心肺衰竭而導致死亡，這可能也歸咎于神經系統感染及全身炎癥反應。

一些特定的臨床指征也可以成為EV71重癥感染患者早期預警指標，其中，主要是屬于神經系統癥狀指征，如肢體癱瘓、嗜睡、精神差、驚跳等，也包括呼吸系統和循環系統癥狀。對EV71手足口病進行臨床特征回顧性分析，發現重癥手足口病多發生于3歲以下兒童，有發熱和皮疹，外周血白細胞計數升高、中性粒細胞比例升高，血糖升高，神經系統異常表現以精神差、驚跳、肢體抖動最為常見，危重病例有循環和呼吸系統異常表現。重型病轉化為危重型病有11個預警征兆，即布氏癥、肢體癱瘓、肺部痰鳴音、腱反射減弱或消失、瞳孔對光反射消失、四肢發涼、嗜睡、精神差、呼吸節律改變、心率加快、手足抖動。高血糖、白細胞增多和肢體癱瘓是神經源性肺水腫的危險因素，其中高血糖，尤其是患者的血糖值高于8.3mmol/L，是最能夠預測病情發展的臨床指標，并且，所有出現肺水腫的患者均有高血糖的征兆。