人大細胞肺癌H460紅色熒光標記腫瘤模型

該小動物模型飼養在清潔級動物中，微生物處于監控狀態，動物房有相應的保護措施，小鼠不會出現逃逸，不會對外界環境造成影響。

圖1 皮下接種H460-RFP腫瘤生長影像分析

圖2 熒光標記腫瘤生長曲線

應用小動物活體熒光成像系統可監測到紅色熒光蛋白在裸小鼠皮下的穩定表達，從第1周至第5周，隨著腫瘤移植時間的增加，表達紅色熒光蛋白的面積逐漸增大，熒光光子數也逐漸增加，移植瘤體積與熒光光子數成正相關（圖1、圖2）。

模型制作采用BALB／CA-nu裸小鼠，鼠齡5周，體重15—18 g，在無特定病原體(specific—pathogen free，SPF)的飼養間飼養。

1. 細胞培養：H460細胞為本實驗室凍存

2. 構建帶有篩選標記的載體：chicken-β-actin- promoter-DsRed

圖1紅色熒光表達載體的構建

3. 細胞轉染和篩選：采用Lipofectamine 2000 Reagent轉染H460細胞。轉染后，用含G418的培養液篩選細胞，獲得穩定表達RFP的細胞株，選擇其中高表達的克隆株擴大培養（圖2）。

圖2紅色熒光標記的H460細胞系（200×）

穩定高表達RFP的細胞，在熒光顯微鏡下均呈強熒光，并且熒光較均勻的分布于整個細胞內。單克隆RFP細胞在無G418篩選壓力下，傳代數次后仍能穩定高水平表達RFP(圖2)。細胞形態和未轉染細胞無明顯區別。

4. 腫瘤細胞的植入及活體熒光成像：收集處于生長對數期的高表達細胞株，進行裸鼠皮下接種，采用活體熒光影像系統攝像動態觀察。

一、 大細胞肺癌

大細胞肺癌起源于支氣管粘膜上皮，局限于基底膜內者稱為原位癌。癌腫可向支氣管腔內或和臨近的肺組織生長，并可通過淋巴、血行或經支氣管轉移擴散。其生長速度和轉移擴散的情況與具體的組織學類型、分化程度等生物學特性有一定關系。大細胞肺癌常發生于肺上葉，多為周圍型，體積較大，邊界清楚，分葉，少見空洞。根據其病理類型可分為4類：（1）大細胞神經內分泌癌 這是一類顯示神經內分泌分化的大細胞癌。細胞較大，呈多角形，胞質嗜酸，核多形，核仁較明顯，核分裂像多見，常見大面積壞死。免疫組化染色，神經內分泌標記陽性，電鏡下可見神經內分泌顆粒；（2）基底細胞樣癌 細胞較大，立方形或梭形，分葉狀或實性巢狀排列，周邊部癌細胞呈柵欄狀排列；（3）淋巴上皮瘤樣癌 罕見。組織形態與鼻咽部淋巴上皮瘤樣癌相同。癌細胞打，泡狀核，核仁明顯，細胞成片或呈巢狀，癌巢內及間質中有淋巴細胞侵潤；（4）透明細胞癌罕見。瘤細胞打，多角形，胞質透明或泡沫狀，無粘液，伴或不伴糖原。伴橫紋肌樣表型的大細胞癌罕見。細胞核大，多形性，胞質豐富，有嗜酸性小球，免疫組織化學既表達上皮性抗原，也顯示橫紋肌表型。

二、 臨床表現及致病機理

肺大細胞癌的臨床癥狀及表現與其他類型肺癌相似，均表現為咳嗽、咯血、胸痛等癥狀，晚期肺癌壓迫鄰近器官、組織或發生遠處轉移時，可以產生：①壓迫或侵犯膈神經，引起同側膈肌麻痹。②壓迫或侵犯喉返神經，引起聲帶麻痹聲音嘶啞。③壓迫上腔靜脈引起面部、頸部、上肢和上胸部靜脈怒張、皮下組織水腫、上肢靜脈壓升高。④侵犯胸膜，可以引起胸腔積液，多為血性。⑤癌腫侵入縱隔，壓迫食管，可引起吞咽困難。⑥上葉頂部肺癌，亦稱Pancoast腫瘤或肺上溝瘤，可以侵入和壓迫位于胸廓上口的器官或組織，如第一肋骨、鎖骨上動脈和靜脈、臂叢神經、頸交感神經等，產生胸痛、頸靜脈或上肢靜脈怒張、水腫、臂痛和上肢運動障礙，同側上眼瞼下垂，瞳孔縮小，眼球內陷，面部無汗等頸交感神經綜合征。少數癌腫產生內分泌物質，臨床上呈現非轉移性的全身癥狀：如骨關節綜合征（杵狀指、關節痛、骨膜增生等）、Cushing綜合征、重癥肌無力、男性乳腺增大、多發性肌肉神經痛等肺外癥狀。這些癥狀在切除肺癌后可能消失。但大細胞還有另外的臨床特點：（1）病程短、易侵犯相鄰肺葉：肺大細胞癌較之鱗癌和腺癌分化差、增殖快、病程短，且肺大細胞癌呈侵襲性生長，發展迅速，是高度惡性神經內分泌腫瘤，早期即可出現淋巴和血行轉移，易侵及相鄰肺葉；（2）肺大細胞癌好發于男性重度吸煙者：吸煙與肺癌的關系眾所周知，在我國男性吸煙者比率也是大于女性吸煙者，因此在臨床上肺大細胞癌大多為男性，且均有長期吸煙史；（3）以周圍型病變多見：在放射學檢查時，肺部腫瘤周圍型病變多見，約占80%以上，腫塊未密度均勻的團塊狀陰影，無空洞形成，腫瘤周圍欠規則，且腫塊巨大，直徑在8cm以上，常伴縱膈淋巴結轉移。

大細胞肺癌和其他病理類型的肺癌一樣，確切的發病原因至今尚欠了解。經過多年的大量調查研究，目前認為與下列因素有密切關系：（1）吸煙 幾乎所有肺癌患者的發病與吸煙有關。吸煙者肺癌死亡率比不吸煙者高10-13倍。吸煙量越多，吸煙年限越長，開始吸煙年齡越早，肺癌死亡率越高。戒煙持續15年才與不吸煙者相近。吸紙煙者比吸雪茄，煙斗者患病率高。紙煙中含有各種致癌物質，如苯并芘，為致癌的主要物質。被動吸煙也容易引起肺癌。女性中丈夫吸煙者肺癌危險性增加50%。上海市區的一項調查表明，本人不吸煙而與吸煙的丈夫生活在一起的婦女，肺癌危險性平均升高19%，長期與重度吸煙的丈夫生活者，危險性可升高30%。（2）職業致癌因子 已被確認的致人類肺癌的職業因素包括石棉，無機砷化合物、二氯甲醚、鉻及其他化合物，鎳冶煉，氡及氡子體，芥子體，氯乙烯，煤煙、焦油和石油中的多環芳烴，煙草的加熱產物等。在石棉廠工作的吸煙工人肺癌死亡率為一般吸煙者的8倍，是不吸煙也不接觸石棉者的92倍。可見石棉有致癌的作用，還說明吸煙與石棉有致癌的協同作用。（3）空氣污染 包括室內小環境和室外大環境污染。如室內被動吸煙、燃料燃燒和烹調過程中可能產生的致癌物。有資料表明，室內用煤，接觸煤煙或其不完全燃燒物為致癌的危險因素，特別是對女性腺癌。烹調時加熱所釋放出的油煙霧也是致癌因素，不可忽視。有報道，烹調時處于煙霧彌漫的室內的女性患肺癌的危險度比處于無或少煙霧室內的女性越高60%，且接觸烹飪油煙的次數越多、年限越長，患肺癌的危險性越大。城市中汽車廢氣、工業廢氣，公路瀝青都有致癌物質存在。其中主要是苯并芘。（4）電離輻射 大劑量電離輻射可引起肺癌。輻射的不同射線產生的效應也不同。一般人群中電離輻射來源約49.6%來自自然界，44.6%為醫療照射，來自X線診斷的電離輻射可占36.7%。（5）飲食與營養大量研究顯示維生素A、B、C、E及β胡蘿卜素能夠抑制化學致癌物誘發的腫瘤。一些調查報告認為攝取食物中維生素A含量少或血清維生素A含量低時，患肺癌危險性增高。（6）肺部既往疾病史 大量流行病學調查表明，在對吸煙等混雜因素進行調整后，肺部疾病史（如肺結核、慢性支氣管炎等）尤其是結核瘢痕者，男性患肺癌的危險是正常人群的5倍，女性患肺癌的危險是常人群的10倍。（7）遺傳因素 一個人患肺癌不僅與環境因素有關，而且遺傳因素也起著重要作用。中青年人罹患肺癌的主要危險因素是遺傳和吸煙。日本學者進一步就不同組織類型的發病情況進行遺傳流行病學研究，發現35..8%的肺鱗癌患者有肺癌家族史，與其他人群相比有顯著差別；58.3%的肺泡細胞癌的女性患者有肺癌家族史，并且她們中3/4的人雙親患有肺癌。遺傳因素是女性肺癌的重要危險因素，不僅支持了肺癌的家族史增加個體患肺癌的危險性，而且也說明了女性對肺癌的遺傳易感性比較高。（8）社會心理因素 有關肺癌患者與發病前心理社會因素關系的兵力對照研究提示，精神長期壓抑者OR值為4.14，按人口暴露率8.8%計算，其人群歸因危險度為21.6%。北京市腫瘤防治研究所對北京市近郊區350例肺癌進行1:1配對病例對照研究，發現北京市肺癌效應較強的多種危險因素，即呼吸系統疾病，吸煙史、污染源、家族腫瘤史、家庭不和及精神創傷等式導致肺癌的主要原因。不良生活事件引起癌癥的機制尚未闡明，一般認為不良生活事件使機體產生應激，出現抑郁、憂慮、悲傷、緊張、憤怒或焦慮等負性情緒。過度或持續的應激會導致機體內環境失衡，免疫功能紊亂而發生癌癥。（9）其他危險因素 如內分泌狀況、免疫狀態、體重指數等與肺癌有一定關系；女性肺腺癌與雌激素水平有關等。

三、 模型背景

H460細胞系于1982年由A.F. Gazdar自一個男性大細胞肺癌患者的胸腔積液中培養獲得。與普通肺癌細胞相比，該細胞具有較高水平的p53 mRNA的表達并且無總DNA結構異常。免疫酶標染色顯示，該細胞具有角蛋白和波形蛋白陽性反應，但神經絲三聯體蛋白反應陰性。該細胞是人亞三倍體細胞系，典型的染色體數是57,或者58條染色體數細胞也存在一定的比例，X和Y染色體在所有細胞中都存在2個拷貝數。

無胸腺裸鼠（Nude Mouse，簡稱裸鼠）目前已成為醫學生物學研究領域中不可缺少的實驗動物模型。經過世界各國實驗動物遺傳育種學家的努力，目前已將nu基因導入不同近交系動物，成為系列動物模型，僅小鼠模型一種，已建立了二十余種近交系裸鼠。由于裸鼠的免疫缺陷，在一定情況下，不排斥來自異種動物的組織移植。因此可作移植人類惡性腫瘤的接受體。根據T.Fogh等1979～1980年的報導，已有150株人的瘤細胞和人體原發癌移植于裸鼠獲得成功，目前已成功地結腸癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、腎癌、宮頸癌、軟組織肉瘤和骨肉瘤等移植于裸鼠、獲得了一定百分比（35.7%）的良好生長，并可傳代。若用已建株的人體腫瘤組織培養細胞作移植材料，接種后的成活率更高（41%）。

本實驗中所用鼠種BALB/C-nu/nu，系1973年從丹麥引入日本中央實驗動物所研究。繼續培育三年后，交由日本CLEA株式會社進行生產。1980年由CLEA引入。雄鼠是無胸腺裸鼠（BALB/C-nu/nu），雌鼠是有胸腺的雜合小鼠（BALB/C-nu/+）。采用BALB/C-nu/+♀與BALB/C-nu/nu♂隨機交配法進行繁殖，已取得較好成果，裸鼠的生產性能良好：受胎率達81.5%，平均產仔率8.1只/窩，平均產裸仔率3.99只/窩，窩平均仔鼠成活3.62只，9周齡仔鼠成活率100%，其主要項目數據與日本中央實驗動物研究所（CLEA）和英國實驗動物中心（LAC）發表的材料基本一致。