東莨菪堿誘導老年癡呆癥小鼠模型

給予動物鼠籠傾斜、潮濕墊料、高溫、噪音、束縛、電擊、游泳、晝夜節律顛倒等不同刺激因子，且刺激因子安排為多變性和不可預測，可誘導性是模型制造成功的關鍵。該模型被廣泛用于抑郁癥神經生物學機制及抗抑郁藥物的研究，以及伴發的焦慮、學習記憶障礙及防護藥物研究。

本研究中，通過水迷宮實驗、避暗實驗結果可以看CUMS模型組水迷宮尋臺潛伏期顯著性延長，避暗錯誤次數顯著性增加、避暗潛伏期顯著性減少等，這些行為學結果，提示大小鼠CUMS模型成功。此外本實驗還對CUMS模型的機制進行了基礎研究，認為CUMS模型會導致動物皮層的5-HT、DA、Ach、NE等神經遞質水平顯著性降低（P<0.05）。因此我們認為采用慢性不可預測應激，35天可以造成大鼠和小鼠學習記憶障礙。

模型技術難點在于對于CUMS刺激因子的選擇，刺激因子的選擇可能影響實驗模型的成功與否，常用的刺激因子有禁食(12 h)、禁水(12 h)、冷水游泳(4 °C，5 min)、熱水游泳(42 °C，5 min)、動物叫聲(0.5 h)、束縛(使用自行研發的小鼠行為限制器，長20 cm，直徑7 cm)、晝夜顛倒、配對飼養、濕籠、傾籠等。每日選擇2~3 種刺激，并盡量使應激程序符合不可預測的特點，以避免動物產生適應性。相同的刺激因子應該隔3-7日再進行。

本研究通過不同的刺激因子對老鼠造成慢性不可預測應激模型，通過水迷宮、避暗等經典行為學指標，以及5-HT、DA、Ach、NE等神經遞質基礎機制指標，表明了慢性不可預測應激誘導老鼠學習記憶損傷模型的成功，并且該模型對于大小鼠具有相同的效果，本模型可用于進一步的改善學習記憶藥物的藥效學評價。

本實驗采用健康成年SPF級老鼠。飼料墊料均為高壓滅菌產品，購自北京維通利華實驗動物有限公司，動物用水均經過除菌處理。實驗動物以完整的包裝直接進入實驗室，觀察適應5天后無異常情況，方進行實驗。實驗過程中動物操作均符合動物倫理學規范，對環境和生態影響等符合國家相關法律規定。

1. 不同劑量SCOP對小鼠自主活動的影響

結果如圖1所示，腹腔注射系列濃度SCOP后，SCOP各劑量組總路程均較正常組明顯升高，呈劑量依賴關系，隨著檢測時間延長，總路程逐漸減少。各組在腹腔注射SCOP 35min后自主活動度基本趨于穩定。

圖 1 東莨菪堿對C57BL/6J 小鼠自主活動的影響

(n=8，means ± SEM). * P<0.05, ** P<0.01 和對照組相比

2. 不同劑量SCOP對小鼠空間學習記憶的影響

如圖2所示，各劑量SCOP均能明顯損害小鼠空間參考記憶能力，呈劑量依賴性，表現為定航實驗中，潛伏期和總游程顯著延長、游出率明顯減少，小鼠游泳的平均速度也受到明顯影響。其中SCOP 1 和2 mg/kg對空間記憶能力損害最為明顯，SCOP模型小鼠的搜索策略為典型的邊緣型搜索，訓練4天時間幾乎沒有小鼠尋找到平臺。

而由于水迷宮直徑為130cm，對于小鼠來說，難度太大，在空間探索實驗中，正常組小鼠成績并不理想，SCOP模型組與正常組比較，穿臺次數、原實臺象限游程比和時間比均無顯著性差異（圖3）。

圖2 東莨菪堿在水迷宮實驗中對空間參考記憶的獲得的影響

(A)逃避率 (%). (B) 總路程(cm). (C) 逃避潛伏期 (sec). (D) 平均速度(cm/s). * P<0.05, **P<0.01 和對照組相比.

圖3 東莨菪堿在水迷宮實驗中對記憶保留的影響

（n=8，mean±S.E.M）(A) 穿臺次數 (B) 目標象限停留時間 (%)

健康雄性C57BL/6J小鼠，SPF級，8周齡，購自中國醫學科學院實驗動物中心。常規飼養。

1.藥品的制備

實驗前，以0.9%的生理鹽水溶解東莨菪堿，配制0.1mg/mL（或其他所需濃度）的溶液。溶液配制需在避光條件下完成，且溶液需置于棕色瓶中暫時儲存。

2.造模方法

適應性飼養3天后，根據隨機表將小鼠隨機分為5個組：正常組、SCOP各劑量組（0.25、0.5、1、2 mg/kg/d），于每次行為學檢測前半小時腹腔注射不同劑量SCOP進行造模，給藥體積為0.2ml/10g。

3. 模型分析指標

（1）自主活動測試 小鼠自主活動實時檢測分析處理系統進行自主活動實驗，檢測時，將小鼠沿壁放入將小鼠置于測試箱適應2~ 3min后，設定參數后開始實驗。軟件自動采集分析動物10 min內運動軌跡，通過總路程、平均速度、運動總時間、靜息總時間反映動物自主活動情況。

（2）水迷宮實驗（Morris water maze）

水迷宮空間記憶

迷宮分為 4 個象限，將平臺置于其中一個象限中央，作為實驗中動物逃離水環境的唯一途徑， 空間記憶階段保持平臺位置固定不變。選擇其余 3 個象限作為動物的入水點將動物面向池壁放入水中，每天訓練 3 次，每次變換入水點位置( 使動物可分別從 3 個象限入水)，且每天所有動物入水點的順序保持一致。每次訓練前適應 10 s，使動物獲取并學習空間環境信息。設置檢測時間為 60s 后，將動物放入水中，若動物在 60 s 內找到平臺，算作尋臺成功并記錄其潛伏期，并使其在平臺上停留休息 10 s。若動物在 60 s內未找到平臺，結束此次訓練并記錄潛伏期為 60 s，并引導動物靠近平臺使其在平臺上停留 10 s。每只動物訓練的時間間隔為 40 min。每天每只動物 3 次訓練學習的潛伏期平均值，作為評價動物這一天學習能力的指標。經過 5d 的訓練學習后，第 6 天撤去平臺， 進行空間探索實驗。將動物從原平臺象限的對角象限面向池壁放入水中，檢測其在 60s 內在原平臺象限的游程比、時間比，以及穿過原平臺所在位置的次數，作為評價空間記憶能力的指標。

癡呆為一種后天獲得性智能障礙綜合癥，是指意識清晰的病人，由于大腦器質性或代謝性病變造成的持續性、進行性智能衰退。老年性癡呆系指65歲以上老年人患有的癡呆。主要有阿爾茨海默癡呆（AD）和血管性癡呆（VD）。阿爾茨海默?。ˋD）是一種起病隱匿的進行性發展的神經系統退行性疾病。由德國神經病理學家Alois?Alzheimer于1906年最先描述。

臨床上以記憶障礙、失語、失用、失認、視空間技能損害、執行功能障礙以及人格和行為改變等全面性癡呆表現為特征，通常表現為一組癥候群，一般具有慢性或進行性的特點，出現多種腦高級皮質功能的紊亂，其中包括：記憶、思維、定向、理解、計算、學習能力、語言和判斷功能等，偶爾以情緒控制失常和社會行為異常為前驅癥狀，其特征性病理變化為大腦皮層萎縮，并伴有β-淀粉樣蛋白 (β-amyloid，β-AP)沉積，神經原纖維纏結 (neurofibrillary tangles，NFT)，大量記憶性神經元數目減少，以及老年斑(senileplaque，SP) 的形成。傳統上認為膽堿能遞質缺乏是老年性癡呆的主要原因。老年性癡呆患者認知功能損傷與腦內神經遞質乙酰膽堿（Acetylcholine, Ach）水平下降密切相關。采用M膽堿受體阻斷劑東莨菪堿（scopolamine, SCOP），使腦內Ach水平顯著下降，可穩定誘導學習獲得障礙，其操作簡便，被廣泛應用于防治老年性癡呆藥物篩選及評價。

早期癥狀包括：（1）記憶：記憶力減退；時間和定向力減退；思維和判斷力減退。（2）行為：喪失主動性，缺乏生活和工作熱情；情緒淡漠或變得易于緊張和激動。（3）日常生活能力：需要更長的時間完成以前能勝任的工作和家務。晚期表現：（1）記憶：記不清家人和鏡子中的自己；不能寫出自己的名字，不會簡單的加減法；不能用語言進行溝通；（2）行為：身體出現抽搐，伴有吞咽困難及肢體僵硬，最后將臥床不起；穿衣吃飯等行為十分異常；（3）日常生活能力：幾乎完全喪失生活自理能力：自己不能控制大小便。伴隨癥狀-精神及行為異常：幻覺、妄想、抑郁、躁狂、焦慮、睡眠。