EV71感染小鼠輕癥模型

采用病毒滴度為104.5 TCID50/ml的EV71（NX10-147）經腹腔注射感染9日齡BALB/c乳鼠，建立重癥小鼠模型，6 dpi重癥模型小鼠發生后肢癱瘓最終導致死亡；繪制生存率（圖1A），體重增長曲線（圖1B），臨床評分（圖1C）。重癥小鼠模型在5 dpi時，2/7(28.57%)小鼠發生后肢癱瘓（圖2），在7 dpi時，4/7(57.14%)小鼠表現癱瘓，其體重也下降，11~12 dpi重癥小鼠出現死亡，生存率為71.43%(5/7)，其中存活的小鼠中60%(3/5)出現癱瘓后遺癥。

圖1. EV71毒株（NX10-147）104.5 TCID50經腹腔注射感染乳鼠建立重癥小鼠模型的生存率、體重、臨床評分

A.生存率; B. 體重; C. 臨床評分

圖2. 重癥EV71小鼠模型主要癥狀

1.重癥小鼠模型各組織病毒載量檢測

為了進一步探討重癥EV71小鼠模型體內病毒載量情況，采用RT-PCR對3 dpi和5 dpi重癥小鼠腦、脊髓、骨骼肌、空腸和肺組織進行病毒核酸檢測（圖3），發現以上各組織在3 dpi和5 dpi 均檢測到EV71病毒，其中，檢測到重癥模型3 dpi骨骼肌中的高病毒載量（107.0 copies/mg），其中，3 dpi 在重癥模型腦組織中均檢測到低病毒載量(102.0 copies/mg)，5 dpi腦組織中病毒載量增加到104.0 copies/mg，說明5 dpi EV71病毒造成中樞神經系統感染加重。3 dpi在重癥模型脊髓、空腸和肺組織中的病毒載量104.0 copies/mg，5 dpi 病毒載量無明顯變化，重癥小鼠模型中均檢測到骨骼肌和脊髓中較高的病毒載量，說明這些組織是病毒復制并傳播到腦組織的重要部位。

圖3. EV71毒株（NX10-147）104.5 TCID50經腹腔注射感染乳鼠建立重癥小鼠模型的組織內病毒載量

2.重癥小鼠模型組織病理學變化

運用組織病理學和免疫組織化學技術，對重癥小鼠模型的各組織器官進行病理學觀察。空白對照組小鼠未見明顯病理變化，并且EV71抗原呈陰性反應。

對重癥小鼠模型（NX10-147）進行組織病理學觀察（圖4），發現3 dpi和5 dpi 小鼠后肢骨骼肌發生嚴重的壞死性肌炎，肌纖維斷裂，大量炎性細胞浸潤，主要有淋巴細胞、嗜中性粒細胞、巨噬細胞；3 dpi 小鼠脊髓和腦干發生細胞源性水腫，神經元發生變性，偶見壞死，5 dpi小鼠脊髓前角運動神經元變性壞死，出現紅色神經元，并可見衛星現象和嗜神經現象，腦干組織中的神經元發生不同程度的變性壞死，并且可見腦干和脊髓神經元中的尼氏小體消失；5 dpi肺臟發生大面積間質性肺炎，間質增寬，炎性細胞浸潤，肺泡間隔毛細血管淤血，3 dpi和5 dpi肺臟發生局灶性肺氣腫；3 dpi和5 dpi空腸黏膜上皮細胞發生大面積空泡變性。免疫組織化學檢測發現在上述嚴重病變的組織中可觀察到EV71特異性抗原分布（圖5），在3dpi和5 dpi時，脊髓、腦干、空腸和骨骼肌檢測到較強的陽性EV71抗原信號，提示在這些組織中病毒復制活躍，然而在5 dpi時，肺臟檢測到中等強度陽性EV71抗原信號。

圖 4. 重癥小鼠模型各組織的組織病理學檢測

圖注：9日齡BALB/c乳鼠腹腔注射104.5 TCID50 EV71毒株（NX10-147），3dpi和5dpi解剖取材，圖片顯示各組別的典型組織照片（×200），箭頭指示5dpi各組織典型病理變化，對照組小鼠組織未見明顯病理變化。

圖5. 免疫組織化學方法檢測重癥小鼠模型各組織中的EV71VP2蛋白

圖注：重癥小鼠的骨骼肌、脊髓、腦干、肺以及空腸組織中可檢測到陽性EV71抗原（棕黃色顆粒）（×200），在空白對照組的上述組織中未見陽性EV71抗原。

3.重癥小鼠模型血清細胞因子檢測

對重癥小鼠模型進行血清細胞因子檢測從血清細胞因子方面揭示重癥發生機制。本研究采用CBA方法檢測了重癥小鼠的3、6、12 hpi 以及1、2、3、5、7、9 dpi的血清細胞因子IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、TNF-α、IFN-γ，以及MCP-1、CCL5/RANTES的動態變化（圖6）。結果發現，這些血清因子中，IL-5、IL-13、IL-6、MCP-1、CCL5、TNF-α在重癥小鼠中發生某時間點的爆發性濃度增高，與空白對照組小鼠血清因子相比，發現重癥小鼠血清爆發性增高的細胞因子分別是3 hpi重癥IL-5上調4倍；48 hpi重癥IL-13上調1.2倍；3 dpi重癥IL-6、MCP-1都上調100倍以上；3 dpi和7 dpi重癥CCL5/RANTES分別上調9倍和10倍；重癥小鼠模型中的IFN-γ在5 dpi時達到峰值，重癥為10倍；7 dpi重癥TNF-α和MCP-1分別上調4倍和87倍。以上數據說明，IL-5和IL-13可能是EV71小鼠實驗感染早期炎癥反應的主要因素，并且細胞因子IL-6、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、CCL5/RANTES在重癥EV71實驗感染的免疫病理損傷中發揮重要作用。

圖6. 動態檢測重癥小鼠血清中的炎性細胞因子變化

圖注：流式細胞小球微陣列術（CBA）檢測血清中細胞因子濃度變化：A.IL-5; B. IL-13; C. IL-6; D. MCP-1; E. CCL5/RANTES; F. TNF-α; G. IFN-γ. 感染后出現因子濃度變化倍數比較顯示在圖H中。

4. EV71重癥小鼠模型的氣道阻力和血氣分析

對小鼠的氣道阻力進行分析，發現小鼠的吸氣時間延長，呼吸頻率降低，分鐘通氣量顯著降低（圖7），符合限制性通氣不足的特征，可能是小鼠死亡的主要原因之一。

采用血氣分析方法對EV71重癥小鼠模型組和對照組小鼠的呼吸效果進行分析，與對照組相比，4 dpi感染組小鼠的氧分壓（PO2）和氧飽和度（sO2）均明顯下降，PO2 由62.2 mmHg下降到 46.75 mmHg，差異極顯著（p < 0.01）（圖8A）；sO2由90.6 %下降到76.5 %，差異極顯著（p< 0.01）（圖8B），PO2和sO2的變化提示EV71重癥模型組小鼠處于缺氧狀態。并且發現二氧化碳分壓（PCO2）和二氧化碳總量（TCO2）有所上升，PCO2由27.22 mmHg增加到46.25 mmHg，差異顯著（p< 0.05）（圖8D）；TCO2由24.00 mmol/L 增加到25.75 mmol/L（圖8E），PCO2的變化提示EV71重癥模型組小鼠肺通氣效果可能存在障礙。進一步發現了血液酸堿度pH值和細胞外液堿剩余（BEecf）均明顯下降，pH值由7.42下降到7.33，差異顯著（p< 0.05）（圖8C）；BEecf由1 mmol/L降低到–2.25 mmol/L，差異顯著（p < 0.05）（圖8F），提示重癥模型組小鼠可能處于呼吸性酸中毒的狀態。以上血氣結果結合肺臟組織病理變化，說明EV71重癥模型組小鼠肺臟通氣功能低下，處于缺氧和呼吸性酸中毒的病理狀態。

圖7.重癥EV71小鼠模型的氣道阻力分析

圖8. EV71感染小鼠導致血液各項指標變化。

圖注：4 dpi模型組和對照組小鼠血液中的(A) 氧分壓PO2,(B) 氧飽和度sO2,(C)pH值,(D) 二氧化碳分壓PCO2,(E) 二氧化碳總量TCO2,(F) 細胞外液堿剩余BEecf指標檢測。

5. EV71小鼠模型超微病理學變化

對照組小鼠肌肉組織可見橫紋明顯，每條肌原纖維都可見清晰明帶和暗帶交替排列，肌質內含有豐富的線粒體、肌原纖維、高爾基復合體、溶酶體、糖原顆粒等肌漿內含物，糖原顆粒散在分布于肌原纖維間和肌漿中（圖9A），肌細胞內可見清晰的線粒體，或在肌纖維間排列，其內外膜和嵴突結構清晰可見（圖9B）。感染組小鼠肌肉組織超微病變明顯，表現為肌組織橫紋消失，明暗帶模糊甚至消失，肌組織發生退行性變，細胞內出現水腫，部分肌原纖維發生溶解，肌質中的胞漿內容物減少，糖原顆粒甚至消失（圖9C）；線粒體腫脹、空化，基質電子密度降低，內室腫脹，嵴和膜結構模糊，嵴突變短減少，崩解消失，形成灶性空化（圖9D）；骨骼肌細胞核固縮，染色質邊集，異染色質明顯增多，發生變性、壞死。并且在肌纖維間可見巨噬細胞、中性粒細胞等炎性細胞浸潤。

對照組腦組織中神經元胞漿中的細胞器豐富，內質網發達，平行或不規則排列，其間游離存在核糖體（圖10A）；線粒體豐富，散布于整個胞體中，線粒體內外膜和嵴突結構清晰（圖10B）；腦組織中有髓神經纖維髓鞘電子密度均勻（圖10C）。感染組腦組織超微病變輕微，神經元細胞器豐富，內質網發達，線粒體豐富（圖10D）；神經元胞漿中可見少量空泡，部分線粒體內室腫脹(圖10E)；有髓神經纖維髓鞘發生層面分離，導致小泡性分離，呈現泡狀改變（圖10F）。

對照組脊髓前角神經元常染色質明顯，異染色質少，細胞器豐富（圖11A）；脊髓前角神經元胞質中線粒體豐富，內質網發達（圖11B）。感染組脊髓前角神經元中粗面內質網擴張，出現尼氏小體溶解，核周見微空泡形成；胞核皺縮，異染色質增多，細胞器減少，粗面內質網和高爾基復合體呈現不同程度的擴張，細胞質呈篩狀外觀，并伴隨不同程度的多聚核糖體丟失，導致粗面內質網脫顆粒；線粒體腫脹，線粒體嵴突腫脹，嵴數量減少（圖11C）。小膠質細胞包圍吞噬神經元細胞，呈現嗜神經現象（圖11D）。

對照組肺組織中I型上皮細胞扁平，其細胞核內可見呈淺亮的常染色質和呈深色顆粒狀的異染色質，胞質少而薄，胞漿內可見少量細胞器，與周圍細胞連接緊密（圖12A）；肺組織中的II型上皮細胞核大而圓，常染色質細密，異染色質少，粗面內質網、高爾基復合體、溶酶體等細胞器豐富（圖12B）；II型上皮細胞胞漿中可見清晰的特征性包含物——嗜鋨性板層小體（圖12C）。感染組肺組織中I型上皮細胞核中染色質邊集，呈不規則堆積，并且與周圍細胞之間連接松弛（圖12D）；肺組織中II型上皮細胞核形狀不規則，染色質邊集，核周細胞質電子密度降低，粗面內質網、核糖體、高爾基復合體等細胞器減少，胞質出現細小空泡變（圖12E），嗜鋨性板層小體或出現排空現象，溶酶體增多（圖12F）；肺泡壁中的細胞成分增多，其中肺泡II型上皮細胞增生，發生了間質性肺炎。

圖9. 骨骼肌的超微病理變化

圖注：A.對照組肌組織橫紋明顯，每條肌原纖維都可見清晰明帶和暗帶交替排列；B.對照組肌細胞胞漿內可見線粒體內外膜和嵴突結構清晰；C.感染組肌肉橫紋消失，肌原纖維溶解，線粒體腫脹、空泡化；D.感染組肌組織線粒體腫脹，表現為內室腫脹，嵴和膜結構模糊。

圖10. 腦組織的超微病理變化

圖注：A.對照組腦組織神經元細胞器豐富，內質網發達，線粒體豐富；B.對照組腦組織神經元中線粒體內外膜和嵴突結構清晰；C.對照組腦組織中有髓神經纖維髓鞘電子密度均勻；D.感染組腦組織神經元細胞器豐富，內質網發達，線粒體豐富；E.感染組腦組織神經元胞漿中可見少量空泡，部分線粒體內室腫脹；F.感染組腦組織中有髓神經纖維髓鞘發生小泡性分離，呈現泡狀改變。

圖11. 脊髓的超微病理變化

圖注：A.對照組脊髓前角神經元常染色質明顯，異染色質少，細胞器豐富；B.對照組脊髓前角神經元胞質中線粒體豐富，內質網發達；C.感染組脊髓前角神經元中線粒體腫脹，粗面內質網擴張，脫顆粒，尼氏小體消失，核周見微空泡形成；D.感染組中小膠質細胞包圍吞噬脊髓前角神經元，呈現嗜神經現象。

圖12. 肺臟的超微病理變化

圖注：A.對照組肺組織中 I型上皮細胞扁平，可見常染色質和異染色質，可見少量細胞器；B.對照組肺組織中II型上皮細胞核大而圓，常染色質細密，異染色質少，細胞器豐富；C.對照組肺組織中可見清晰的嗜鋨性半層小體；D.感染組肺組織中I型上皮細胞核中染色質邊集，呈不規則堆積，與周圍細胞之間連接松弛；E.感染組肺組織中II型上皮細胞核形狀不規則，染色質邊集，細胞器減少；F.感染組肺組織中的II型上皮細胞胞質細小空泡變，嗜鋨性板層小體排空，溶酶體增生。

H1PV為低于人間傳染病名錄三級安全風險的病原，人類感染風險低。

H1PV是大鼠必須排除的病原體，對動物有致病性。會干擾其他實驗研究。

鑒于此，此感染實驗必須在BSL-2級以上的生物安全實驗室進行病原學實驗，在ABSL-2實驗室進行動物實驗。

3 腸道病毒71型輕癥小鼠模型各指標檢測

3.1 輕癥EV71小鼠模型建立

采用EV71臨床分離株（NX10-36）病毒建立輕癥小鼠模型，用104.5 TCID50/ml的病毒滴度經腹腔注射感染9日齡BALB/c乳鼠，6 dpi輕癥小鼠發生豎毛的臨床表現；對輕癥EV71小鼠模型連續觀察14天，繪制生存率（圖1A），體重增長曲線（圖1B），臨床評分（圖1C）。所有小鼠存活到14 dpi，并且其體重增長與空白對照組小鼠無差異（p > 0.05）。

3.2 輕癥小鼠模型各組織病毒載量檢測

為了進一步探討輕癥EV71小鼠模型體內病毒載量情況，采用RT-PCR對3 dpi和5 dpi輕癥小鼠腦、脊髓、骨骼肌、空腸和肺組織進行病毒核酸檢測（圖1D），發現以上各組織在3 dpi和5 dpi 均檢測到EV71病毒，其中，檢測到輕癥模型3 dpi骨骼肌中的高病毒載量（106.0 copies/mg），5 dpi病毒載量未見明顯增加，其中，3 dpi 在輕癥模型腦組織中均檢測到低病毒載量(102.0 copies/mg)，5 dpi腦組織中病毒載量均增加到104.0 copies/mg。3 dpi在輕癥模型脊髓、空腸和肺組織中的病毒載量在103.0 到104.0 copies/mg，5 dpi 病毒載量無明顯變化。輕癥小鼠模型中均檢測到骨骼肌和脊髓中較高的病毒載量，說明這些組織是病毒復制并傳播到腦組織的重要部位。

圖1. EV71毒株（NX10-36）104.5 TCID50經腹腔注射感染乳鼠建立輕癥小鼠模型的生存率、體重、臨床評分和組織內病毒載量

A.生存率; B. 體重; C. 臨床評分; D. 各組織內的病毒載量

3.3 輕癥小鼠模型組織病理學變化

運用組織病理學和免疫組織化學技術，對輕癥小鼠模型的各組織器官進行病理學觀察。空白對照組小鼠未見明顯病理變化，并且EV71抗原呈陰性反應。

對輕癥小鼠模型（NX10-36）組織病理學觀察（圖2），發現5dpi 小鼠后肢骨骼肌發生肌炎，多量炎性細胞浸潤，主要有淋巴細胞、巨噬細胞、少量嗜中性粒細胞，而3 dpi肌纖維之間見炎性細胞浸潤，肌細胞未發生壞死；3 dpi和5 dpi脊髓前角和腦干可見少量神經元發生變性，可見血管源性水腫，在5 dpi脊髓神經元尼氏小體消失（圖2-23C）；3dpi在肺臟和空腸中未見明顯病理學變化，5 dpi肺臟發生局灶性間質性肺炎，間質增寬，炎性細胞浸潤，肺泡間隔毛細血管淤血；5 dpi 空腸發生大面積黏膜上皮細胞空泡變性。免疫組織化學檢測結果發現在上述病變的組織中可觀察到EV71特異性抗原分布（圖3），在3 dpi和5dpi脊髓、腦干和骨骼肌檢測到較強的陽性EV71抗原信號，而在肺和空腸組織中檢測到中等強度陽性EV71抗原信號。

圖 2. 輕癥小鼠模型各組織的組織病理學檢測

圖注：9日齡BALB/c乳鼠腹腔注射104.5 TCID50 EV71毒株（NX10-36），3dpi和5dpi解剖取材，圖片顯示各組別的典型組織照片（×200），箭頭指示5dpi各組織典型病理變化，對照組小鼠組織未見明顯病理變化。

圖3. 免疫組織化學方法檢測輕癥小鼠模型各組織中的EV71VP2蛋白

圖注：輕癥小鼠的骨骼肌、脊髓、腦干、肺以及空腸組織中可檢測到陽性EV71抗原（棕黃色顆粒）（×200），在空白對照組的上述組織中未見陽性EV71抗原。

2.1實驗材料

2.1.1 細胞株

橫紋肌瘤細胞（RD）。

2.1.2 實驗動物

SPF級9日齡BALB/c乳鼠，每窩5 ~ 7只，母鼠自然哺乳。

2.1.3 病毒

EV71臨床分離株基本信息見表1。

表1. EV71臨床分離株基本信息

2.1.4 病毒培養與病毒TCID50的測定

RD細胞貼壁覆蓋細胞培養瓶生長成單層后，分別接種EV71病毒株，24 hpi觀察細胞形態，待90%的細胞發生細胞病變時，將細胞培養瓶置于–80℃冰箱中，并反復凍融3次后，經離心后分裝病毒液并低溫保存。采用常規方法測定TCID50。在BSL-2實驗室中進行。

2.2 輕癥EV71小鼠模型建立

根據前期結果確定攻毒量，建立輕癥EV71小鼠模型，9日齡BALB/c乳鼠輕度麻醉后，經腹腔注射104.5 TCID50 EV71臨床分離株NX10-36(GenBank登錄號KJ004557)，攻毒劑量為250 μl/只；空白對照組乳鼠(n=12)腹腔注射等量RD細胞上清，其中3只取其血清作為對照組血清。在3 dpi和5 dpi每組各剖殺3只乳鼠，立即取其腦干、脊髓、肺臟、后肢骨骼肌和空腸固定在4 %多聚甲醛中，以備組織病理學檢測；同時，每組另剖殺3只乳鼠取以上組織凍存，以備病毒RNA提取和組織內病毒載量測定。

2.3 輕癥EV71小鼠模型鑒定方式

輕癥EV71小鼠模型臨床癥狀主要表現為豎毛，不出現后肢癱瘓或死亡。

EV71小鼠模型臨床癥狀評分如表2所示。

表2. EV71小鼠模型臨床癥狀評分

1概述

1.1 腸道病毒71型手足口病概述

手足口病（hand, foot, and mouth disease, HFMD）是由腸道病毒引起的，以發熱和手、足、口腔、臀部等部位出現皮疹、皰疹或皰疹性咽峽炎為主要特征的一種常見于小兒的急性傳染病。手足口病多發生于入學前兒童，尤其是3歲以內的嬰幼兒，腸道病毒71型（enterovirus71, EV71）是導致手足口病暴發的主要病原體，EV71 手足口病是急性自限性疾病，絕大多數病人會自然痊愈，少數患者會發展為重癥，并發無菌性腦膜炎、腦干腦炎、神經源性肺水腫、急性弛緩性麻痹和心肌炎等，死亡率和致殘率較高。

1.2 EV71致病機理和病理特征

手足口病一般以發熱和手、足、口腔、臀部等部位出現皮疹、皰疹或皰疹性咽峽炎為主要特征。EV71主要通過糞口途徑傳播，病毒從咽部或胃腸道侵入人體內，最初EV71病毒定植于鼻咽部或胃腸局部黏膜，出現皮疹、皰疹或皰疹性咽峽炎，侵入淋巴組織并在其中繁殖，若機體未能及時應答產生足量的中和抗體以清除病毒，則病毒可進一步進入血液，引起第一次病毒血癥，若機體免疫力差，則EV71可進一步擴散入侵全身網狀內皮組織、深層淋巴結、肝、脾、骨髓等組織器官，并大量繁殖，隨后再次入血，引起第二次病毒血癥，EV71最終可侵入靶器官細胞，如腦、腦膜、脊髓、心肌、橫紋肌以及皮膚黏膜等組織，引起重癥病變，導致中樞神經系統的嚴重損害。