EV71感染人PSGL-1轉基因小鼠模型

采用病毒滴度為104.5 TCID50/ml的EV71（NX10-147）經腹腔注射感染9日齡BALB/c乳鼠，建立重癥小鼠模型，6 dpi重癥模型小鼠發生后肢癱瘓最終導致死亡；繪制生存率（圖1A），體重增長曲線（圖1B），臨床評分（圖1C）。重癥小鼠模型在5 dpi時，2/7(28.57%)小鼠發生后肢癱瘓（圖2），在7 dpi時，4/7(57.14%)小鼠表現癱瘓，其體重也下降，11~12 dpi重癥小鼠出現死亡，生存率為71.43%(5/7)，其中存活的小鼠中60%(3/5)出現癱瘓后遺癥。

圖1. EV71毒株（NX10-147）104.5 TCID50經腹腔注射感染乳鼠建立重癥小鼠模型的生存率、體重、臨床評分

A.生存率; B. 體重; C. 臨床評分

圖2. 重癥EV71小鼠模型主要癥狀

1.重癥小鼠模型各組織病毒載量檢測

為了進一步探討重癥EV71小鼠模型體內病毒載量情況，采用RT-PCR對3 dpi和5 dpi重癥小鼠腦、脊髓、骨骼肌、空腸和肺組織進行病毒核酸檢測（圖3），發現以上各組織在3 dpi和5 dpi 均檢測到EV71病毒，其中，檢測到重癥模型3 dpi骨骼肌中的高病毒載量（107.0 copies/mg），其中，3 dpi 在重癥模型腦組織中均檢測到低病毒載量(102.0 copies/mg)，5 dpi腦組織中病毒載量增加到104.0 copies/mg，說明5 dpi EV71病毒造成中樞神經系統感染加重。3 dpi在重癥模型脊髓、空腸和肺組織中的病毒載量104.0 copies/mg，5 dpi 病毒載量無明顯變化，重癥小鼠模型中均檢測到骨骼肌和脊髓中較高的病毒載量，說明這些組織是病毒復制并傳播到腦組織的重要部位。

圖3. EV71毒株（NX10-147）104.5 TCID50經腹腔注射感染乳鼠建立重癥小鼠模型的組織內病毒載量

2.重癥小鼠模型組織病理學變化

運用組織病理學和免疫組織化學技術，對重癥小鼠模型的各組織器官進行病理學觀察。空白對照組小鼠未見明顯病理變化，并且EV71抗原呈陰性反應。

對重癥小鼠模型（NX10-147）進行組織病理學觀察（圖4），發現3 dpi和5 dpi 小鼠后肢骨骼肌發生嚴重的壞死性肌炎，肌纖維斷裂，大量炎性細胞浸潤，主要有淋巴細胞、嗜中性粒細胞、巨噬細胞；3 dpi 小鼠脊髓和腦干發生細胞源性水腫，神經元發生變性，偶見壞死，5 dpi小鼠脊髓前角運動神經元變性壞死，出現紅色神經元，并可見衛星現象和嗜神經現象，腦干組織中的神經元發生不同程度的變性壞死，并且可見腦干和脊髓神經元中的尼氏小體消失；5 dpi肺臟發生大面積間質性肺炎，間質增寬，炎性細胞浸潤，肺泡間隔毛細血管淤血，3 dpi和5 dpi肺臟發生局灶性肺氣腫；3 dpi和5 dpi空腸黏膜上皮細胞發生大面積空泡變性。免疫組織化學檢測發現在上述嚴重病變的組織中可觀察到EV71特異性抗原分布（圖5），在3dpi和5 dpi時，脊髓、腦干、空腸和骨骼肌檢測到較強的陽性EV71抗原信號，提示在這些組織中病毒復制活躍，然而在5 dpi時，肺臟檢測到中等強度陽性EV71抗原信號。

圖 4. 重癥小鼠模型各組織的組織病理學檢測

圖注：9日齡BALB/c乳鼠腹腔注射104.5 TCID50 EV71毒株（NX10-147），3dpi和5dpi解剖取材，圖片顯示各組別的典型組織照片（×200），箭頭指示5dpi各組織典型病理變化，對照組小鼠組織未見明顯病理變化。

圖5. 免疫組織化學方法檢測重癥小鼠模型各組織中的EV71VP2蛋白

圖注：重癥小鼠的骨骼肌、脊髓、腦干、肺以及空腸組織中可檢測到陽性EV71抗原（棕黃色顆粒）（×200），在空白對照組的上述組織中未見陽性EV71抗原。

3.重癥小鼠模型血清細胞因子檢測

對重癥小鼠模型進行血清細胞因子檢測從血清細胞因子方面揭示重癥發生機制。本研究采用CBA方法檢測了重癥小鼠的3、6、12 hpi 以及1、2、3、5、7、9 dpi的血清細胞因子IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、TNF-α、IFN-γ，以及MCP-1、CCL5/RANTES的動態變化（圖6）。結果發現，這些血清因子中，IL-5、IL-13、IL-6、MCP-1、CCL5、TNF-α在重癥小鼠中發生某時間點的爆發性濃度增高，與空白對照組小鼠血清因子相比，發現重癥小鼠血清爆發性增高的細胞因子分別是3 hpi重癥IL-5上調4倍；48 hpi重癥IL-13上調1.2倍；3 dpi重癥IL-6、MCP-1都上調100倍以上；3 dpi和7 dpi重癥CCL5/RANTES分別上調9倍和10倍；重癥小鼠模型中的IFN-γ在5 dpi時達到峰值，重癥為10倍；7 dpi重癥TNF-α和MCP-1分別上調4倍和87倍。以上數據說明，IL-5和IL-13可能是EV71小鼠實驗感染早期炎癥反應的主要因素，并且細胞因子IL-6、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、CCL5/RANTES在重癥EV71實驗感染的免疫病理損傷中發揮重要作用。

圖6. 動態檢測重癥小鼠血清中的炎性細胞因子變化

圖注：流式細胞小球微陣列術（CBA）檢測血清中細胞因子濃度變化：A.IL-5; B. IL-13; C. IL-6; D. MCP-1; E. CCL5/RANTES; F. TNF-α; G. IFN-γ. 感染后出現因子濃度變化倍數比較顯示在圖H中。

4. EV71重癥小鼠模型的氣道阻力和血氣分析

對小鼠的氣道阻力進行分析，發現小鼠的吸氣時間延長，呼吸頻率降低，分鐘通氣量顯著降低（圖7），符合限制性通氣不足的特征，可能是小鼠死亡的主要原因之一。

采用血氣分析方法對EV71重癥小鼠模型組和對照組小鼠的呼吸效果進行分析，與對照組相比，4 dpi感染組小鼠的氧分壓（PO2）和氧飽和度（sO2）均明顯下降，PO2 由62.2 mmHg下降到 46.75 mmHg，差異極顯著（p < 0.01）（圖8A）；sO2由90.6 %下降到76.5 %，差異極顯著（p< 0.01）（圖8B），PO2和sO2的變化提示EV71重癥模型組小鼠處于缺氧狀態。并且發現二氧化碳分壓（PCO2）和二氧化碳總量（TCO2）有所上升，PCO2由27.22 mmHg增加到46.25 mmHg，差異顯著（p< 0.05）（圖8D）；TCO2由24.00 mmol/L 增加到25.75 mmol/L（圖8E），PCO2的變化提示EV71重癥模型組小鼠肺通氣效果可能存在障礙。進一步發現了血液酸堿度pH值和細胞外液堿剩余（BEecf）均明顯下降，pH值由7.42下降到7.33，差異顯著（p< 0.05）（圖8C）；BEecf由1 mmol/L降低到–2.25 mmol/L，差異顯著（p < 0.05）（圖8F），提示重癥模型組小鼠可能處于呼吸性酸中毒的狀態。以上血氣結果結合肺臟組織病理變化，說明EV71重癥模型組小鼠肺臟通氣功能低下，處于缺氧和呼吸性酸中毒的病理狀態。

圖7.重癥EV71小鼠模型的氣道阻力分析

圖8. EV71感染小鼠導致血液各項指標變化。

圖注：4 dpi模型組和對照組小鼠血液中的(A) 氧分壓PO2,(B) 氧飽和度sO2,(C)pH值,(D) 二氧化碳分壓PCO2,(E) 二氧化碳總量TCO2,(F) 細胞外液堿剩余BEecf指標檢測。

5. EV71小鼠模型超微病理學變化

對照組小鼠肌肉組織可見橫紋明顯，每條肌原纖維都可見清晰明帶和暗帶交替排列，肌質內含有豐富的線粒體、肌原纖維、高爾基復合體、溶酶體、糖原顆粒等肌漿內含物，糖原顆粒散在分布于肌原纖維間和肌漿中（圖9A），肌細胞內可見清晰的線粒體，或在肌纖維間排列，其內外膜和嵴突結構清晰可見（圖9B）。感染組小鼠肌肉組織超微病變明顯，表現為肌組織橫紋消失，明暗帶模糊甚至消失，肌組織發生退行性變，細胞內出現水腫，部分肌原纖維發生溶解，肌質中的胞漿內容物減少，糖原顆粒甚至消失（圖9C）；線粒體腫脹、空化，基質電子密度降低，內室腫脹，嵴和膜結構模糊，嵴突變短減少，崩解消失，形成灶性空化（圖9D）；骨骼肌細胞核固縮，染色質邊集，異染色質明顯增多，發生變性、壞死。并且在肌纖維間可見巨噬細胞、中性粒細胞等炎性細胞浸潤。

對照組腦組織中神經元胞漿中的細胞器豐富，內質網發達，平行或不規則排列，其間游離存在核糖體（圖10A）；線粒體豐富，散布于整個胞體中，線粒體內外膜和嵴突結構清晰（圖10B）；腦組織中有髓神經纖維髓鞘電子密度均勻（圖10C）。感染組腦組織超微病變輕微，神經元細胞器豐富，內質網發達，線粒體豐富（圖10D）；神經元胞漿中可見少量空泡，部分線粒體內室腫脹(圖10E)；有髓神經纖維髓鞘發生層面分離，導致小泡性分離，呈現泡狀改變（圖10F）。

對照組脊髓前角神經元常染色質明顯，異染色質少，細胞器豐富（圖11A）；脊髓前角神經元胞質中線粒體豐富，內質網發達（圖11B）。感染組脊髓前角神經元中粗面內質網擴張，出現尼氏小體溶解，核周見微空泡形成；胞核皺縮，異染色質增多，細胞器減少，粗面內質網和高爾基復合體呈現不同程度的擴張，細胞質呈篩狀外觀，并伴隨不同程度的多聚核糖體丟失，導致粗面內質網脫顆粒；線粒體腫脹，線粒體嵴突腫脹，嵴數量減少（圖11C）。小膠質細胞包圍吞噬神經元細胞，呈現嗜神經現象（圖11D）。

對照組肺組織中I型上皮細胞扁平，其細胞核內可見呈淺亮的常染色質和呈深色顆粒狀的異染色質，胞質少而薄，胞漿內可見少量細胞器，與周圍細胞連接緊密（圖12A）；肺組織中的II型上皮細胞核大而圓，常染色質細密，異染色質少，粗面內質網、高爾基復合體、溶酶體等細胞器豐富（圖12B）；II型上皮細胞胞漿中可見清晰的特征性包含物——嗜鋨性板層小體（圖12C）。感染組肺組織中I型上皮細胞核中染色質邊集，呈不規則堆積，并且與周圍細胞之間連接松弛（圖12D）；肺組織中II型上皮細胞核形狀不規則，染色質邊集，核周細胞質電子密度降低，粗面內質網、核糖體、高爾基復合體等細胞器減少，胞質出現細小空泡變（圖12E），嗜鋨性板層小體或出現排空現象，溶酶體增多（圖12F）；肺泡壁中的細胞成分增多，其中肺泡II型上皮細胞增生，發生了間質性肺炎。

圖9. 骨骼肌的超微病理變化

圖注：A.對照組肌組織橫紋明顯，每條肌原纖維都可見清晰明帶和暗帶交替排列；B.對照組肌細胞胞漿內可見線粒體內外膜和嵴突結構清晰；C.感染組肌肉橫紋消失，肌原纖維溶解，線粒體腫脹、空泡化；D.感染組肌組織線粒體腫脹，表現為內室腫脹，嵴和膜結構模糊。

圖10. 腦組織的超微病理變化

圖注：A.對照組腦組織神經元細胞器豐富，內質網發達，線粒體豐富；B.對照組腦組織神經元中線粒體內外膜和嵴突結構清晰；C.對照組腦組織中有髓神經纖維髓鞘電子密度均勻；D.感染組腦組織神經元細胞器豐富，內質網發達，線粒體豐富；E.感染組腦組織神經元胞漿中可見少量空泡，部分線粒體內室腫脹；F.感染組腦組織中有髓神經纖維髓鞘發生小泡性分離，呈現泡狀改變。

圖11. 脊髓的超微病理變化

圖注：A.對照組脊髓前角神經元常染色質明顯，異染色質少，細胞器豐富；B.對照組脊髓前角神經元胞質中線粒體豐富，內質網發達；C.感染組脊髓前角神經元中線粒體腫脹，粗面內質網擴張，脫顆粒，尼氏小體消失，核周見微空泡形成；D.感染組中小膠質細胞包圍吞噬脊髓前角神經元，呈現嗜神經現象。

圖12. 肺臟的超微病理變化

圖注：A.對照組肺組織中 I型上皮細胞扁平，可見常染色質和異染色質，可見少量細胞器；B.對照組肺組織中II型上皮細胞核大而圓，常染色質細密，異染色質少，細胞器豐富；C.對照組肺組織中可見清晰的嗜鋨性半層小體；D.感染組肺組織中I型上皮細胞核中染色質邊集，呈不規則堆積，與周圍細胞之間連接松弛；E.感染組肺組織中II型上皮細胞核形狀不規則，染色質邊集，細胞器減少；F.感染組肺組織中的II型上皮細胞胞質細小空泡變，嗜鋨性板層小體排空，溶酶體增生。

H1PV為低于人間傳染病名錄三級安全風險的病原，人類感染風險低。

H1PV是大鼠必須排除的病原體，對動物有致病性。會干擾其他實驗研究。

鑒于此，此感染實驗必須在BSL-2級以上的生物安全實驗室進行病原學實驗，在ABSL-2實驗室進行動物實驗。

1. 轉基因小鼠鑒定

人PSGl-1轉基因小鼠經RT-PCR和Western blotting鑒定，表明人PSGL-1蛋白主要在小鼠的骨骼肌和腦中表達，可檢測到該基因的mRNA表達及蛋白（圖1）。

2. 動物癥狀

EV71 MP10感染轉基因小鼠后，動物自感染后第3天開始出現癥狀，表現為體重增長變緩、弓背豎毛、后肢行動遲緩至癱瘓、死亡等癥狀。感染后第4天時，動物全部表現出后肢癱瘓、停止進食等癥狀，感染后第5天動物開始出現死亡，在10天內全部死亡，該特征類似于EV71重癥感染小鼠模型。實時熒光定量PCR檢測表明病毒主要復制部位為骨骼肌和腦，病毒在感染后第3天達到高峰，主要病理表現為壞死性肌炎。

圖1. 人PSGL-1轉基因小鼠鑒定.A，人PSGL-1基因設計；B，轉基因小鼠基因型鑒定；C，骨骼肌和腦內人PSGL-1基因的mRNA檢測；D，Westernblotting檢測骨骼肌和腦內人PSGL-1蛋白表達檢測。

3. 轉基因小鼠與野生小鼠模型的區別

制作人PSGL-1轉基因小鼠的主要目的，是驗證表達人PSGL-1蛋白能否提高小鼠對EV71的敏感性，因此，可通過EV71的臨床分離株和小鼠適應株來分別測驗人PSGL-1對EV71感染的促進效果。

圖2. EV71臨床分離株JK2009感染人PSGL-1轉基因小鼠和野生型小鼠后，病毒在骨骼肌中的復制曲線。●野生型小鼠；○轉基因小鼠。

EV71的臨床分離株JK2009感染小鼠后，分別在第1天、3天和5天分離骨骼肌，檢測病毒載量，發現與野生型小鼠相比，轉基因小鼠骨骼肌內的病毒載量并沒有顯著提高（圖2）。

圖3. EV71的小鼠適應株MP10感染轉基因小鼠和野生型小鼠. A-C，組織內病毒載量，A（骨骼肌），B（脊髓），C（腦）；D，臨床癥狀評分的變化曲線；E，感染第3天和第5天時的小鼠狀態照片。

EV71的小鼠適應株MP10感染小鼠后，在第3天時，轉基因小鼠的骨骼肌、脊髓和腦內的病毒載量顯著高于野生型小鼠（圖3A-C），但是在第5天時，該差別不再明顯，表明表達人PSGL-1蛋白可以一過性的促進EV71小鼠適應株感染小鼠。與病毒復制相一致，第3天轉基因小鼠的后肢出現雙側癱瘓，癥狀明顯比野生型小鼠嚴重，但在第5天時癥狀類似（圖3D-E）。提高病毒的感染劑量，并不能使兩周以上的轉基因小鼠表現出明顯的癥狀，表明人PSGL-1具有一定的促進EV71感染效果。

背景品系：C57BL/6J,表達人PSGL-1蛋白的轉基因小鼠，動物品系名稱為：C57BL/6J-TgN(CMV-Homo-PSGL-1)-ZLFILAS。

轉基因小鼠構建

以人PSGL-1的mRNA為模板，經反轉錄獲得人PSGL-1的cDNA，將其插入pCDNA3.1(+)載體的啟動子下游，構建轉基因載體。載體經測序驗證正確后，將其線性化并經顯微注射到C57BL/6J的受精卵中，用129做假孕受體，制備轉基因小鼠。轉基因小鼠提取鼠尾DNA進行基因鑒定（h-PSGL-F: 5’-CTACCAAAAGAGGTCTGTTC-3’；h-PSGL-R:5’-ATGAGATGCAGACCATCTCG-3’），采用RT-PCR法檢測組織內基因表達情況（h-PSGL-CF: 5’-GTGGTGCTGGCGGTCCG-3’；h-PSGL-CR: 5’-CAGGCCCCCATTGGCTGTG-3’），并用兔抗人PSGL-1的多克隆抗體檢測組織內蛋白表達情況。

1. 病毒制備

使用的臨床分離株包括：1.FY0805a，2008年分離自安徽省阜陽市，GenBank存儲號為HQ882182；2.JK2009,2009年分離自重慶市，GenBank存儲號為HQ694982；使用的小鼠適應株為MP10，為FY0805a在小鼠體內連續傳代10次后的小鼠適應株，GenBank存儲號為HQ712020。EV71在人橫紋肌瘤細胞（RD）中培養、繁殖，采用三次凍融法釋放病毒，超速離心法富集病毒，病毒儲存于超低溫冰箱中，病毒儲存液濃度為1×109 TCID50/ml。

2. 實驗動物

可使用SPF級別的10日齡乳鼠，品系為C57BL/6J-TgN(CMV-Homo-PSGL-1) -ZLFILAS，母鼠自然哺乳，在動物生物安全二級實驗室內獨立飼養。

3. 病毒感染

根據預實驗確定感染劑量，10日齡乳鼠經輕度麻醉后，經腹腔注射1×108 TCID50 的EV71JK2009,攻毒體積為100微升/只；小鼠適應株EV71 MP10的感染劑量為5×106 TCID50，注射體積為100微升/只，空白對照組注射等量RD細胞上清。

手足口病是腸道病毒引起的傳染性、出疹性疾病，該病多發生于5歲以下的嬰幼兒，可引起發熱和手、足、口腔等部位的皮疹、潰瘍，個別手足口病患者可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等并發癥，而神經源性肺水腫、肺出血和心力衰竭被認為是導致死亡的主要原因。

引發手足口病的腸道病毒有20多種，包括柯薩奇病毒A組和B組、人腸道病毒71型（EV71）以及皰疹病毒、腺病毒等，其中以柯薩奇病毒A16型(CA16)和腸道病毒71型（EV71）最為常見。而絕大多數重癥手足口病病例，均由EV71或CA16病毒感染所致。

EV71屬于微小RNA病毒科，腸道病毒屬，主要通過糞口傳播，病毒最初定植于鼻咽部或胃腸道粘膜，侵入淋巴組織并在其中繁殖，進而引起第一次病毒血癥。若機體免疫力差，病毒可擴散至全身組織器官，大量繁殖后再次入血，引起第二次病毒血癥，最終侵犯靶器官，如腦、腦膜、脊髓、心肌和橫紋肌以及皮膚黏膜組織，引起重癥病變，尸檢時主要病變為神經元壞死等。

日本學者指出PSGL-1蛋白是人的EV71病毒受體，在小鼠細胞內表達人PSGL-1蛋白可以提高小鼠細胞對EV71的敏感性。建立骨骼肌和神經組織表達人PSGL-1蛋白的轉基因小鼠，可提高小鼠對病毒的敏感性，有望提高敏感小鼠的年齡，從而建立成年的EV71感染模型。