CCKBR基因條件性敲除小鼠模型

胃泌素通過其 CCKBR 受體在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮作用。CCKBR 受體在機(jī)體多個(gè)器官或組織都有表達(dá)，包括腎臟、心臟、血管、消化系統(tǒng)等，即使在腸道，其在腸道平滑肌和腸道上皮細(xì)胞都有表達(dá)。而機(jī)體對(duì)鈉吸收的部位是腸道上皮細(xì)胞，為此，我們構(gòu)建小腸上皮細(xì)胞特異性CCKBR受體基因敲除小鼠（CCKBRfl/fl; VillinCre），即該小鼠小腸上皮細(xì)胞內(nèi)的CCKBR受體被敲除，而體內(nèi)其它器官或組織的 CCKBR 受體表達(dá)和功能正常，對(duì)于肝腎等其他組織功能無影響，更能精準(zhǔn)模擬鈉離子異常吸收導(dǎo)致的高血壓的表型，同時(shí)更好地而模擬人類疾病及并研究相關(guān)機(jī)制和評(píng)價(jià)藥效。

動(dòng)物模型制備過程中，由由基因工程人員設(shè)計(jì)gRNA靶點(diǎn)及活性檢測(cè)，CCKBRflox/flox小鼠與CCKBRflox/flox,VillinCre的繁育和鑒定均由具有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上崗證的專人完成，飼養(yǎng)人員進(jìn)行日常飼喂，由獸醫(yī)進(jìn)行監(jiān)督管理，造模期間動(dòng)物狀態(tài)良好，病死只數(shù)0，未使用微生物，對(duì)環(huán)境沒有影響，造模方法可遺傳。

CCKBRfl/fl; Villin Cre小鼠結(jié)果分析

1、生理生化指標(biāo)分析：

2、腸道CCKBR檢測(cè)結(jié)果：

3.小鼠有創(chuàng)及清醒狀態(tài)血壓結(jié)果：

一、模型設(shè)計(jì)原理：

GRNA介導(dǎo)Cas9蛋白剪切目標(biāo)外顯子兩端的內(nèi)含子DNA，同時(shí)提供同源模板Donor，基因組兩端通過同源重組修復(fù)方式進(jìn)行DNA修復(fù)，在特定外顯子兩端插入FloxP。CCKBR-FloxP小鼠與組織特異性表達(dá)Cre小鼠交配，從而實(shí)現(xiàn)CCKBR基因條件性敲除的目的。實(shí)驗(yàn)采用最新的spCas91.1進(jìn)行注射，減少了基因組中的off-Target。

根據(jù)CCKBR基因組結(jié)構(gòu)和蛋白功能保守區(qū)分析在Exon1的兩邊定點(diǎn)插入FloxP位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)將Exon1條件性敲除。

二、模型設(shè)計(jì)過程：

1) CCKBR基因GRNA靶點(diǎn)設(shè)計(jì)及活性檢測(cè)

在要?jiǎng)h除的Exon1外顯子兩端，設(shè)計(jì)gRNA靶點(diǎn)如下：

Cckbr-L1: GCTTAGTTGGAGCTGAGTGGG

Cckbr-L2: TGCTGGAGCTAGCTTAGTTGG

Cckbr-L3: AGCAGGTGGAACCGGTGCTGG

Cckbr-L4: CGCGGGAGCAGGTGGAACCGG

Cckbr-R1: GGACCTAGGTGGGAGCTGAGG

Reverse Complement: CCTCAGCTCCCACCTAGGTCC

Cckbr-R2: GAGGGGAGGGACCTAGGTGGG

Reverse Complement: CCCACCTAGGTCCCTCCCCTC

Cckbr-R3: TTGGAGTCAGGAGAGCTTGGG

Reverse Complement: CCCAAGCTCTCCTGACTCCAA

Cckbr-R4: TGTGAAGGTGTTGGAGTCAGG

Reverse Complement: CCTGACTCCAACACCTTCACA

使用Cas9/gRNA靶點(diǎn)效率檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：VK007）進(jìn)行g(shù)RNA體外活性檢測(cè)，結(jié)果如下：

gRNA靶點(diǎn)活性檢測(cè)結(jié)果分析如下：

2）CCKBRflox/flox,villinCre小鼠設(shè)計(jì)

3）CCKBRflox/flox,villinCre小鼠模型的繁育及鑒定結(jié)果：

CCKBRfloxp/flox小鼠與Cre 的小鼠（villinCre）雜交，對(duì)后代自交獲得的小鼠進(jìn)行基因型鑒定，成功獲得CCKBR腸道上皮細(xì)胞條件性基因敲除小鼠CCKBRflox/flox,villinCre）。見下圖

經(jīng)鑒定12#: CCKBRflox/flox,villinCre

一、疾病概述

高血壓是一種由環(huán)境因素、遺傳因素和行為因素相互作用產(chǎn)生的復(fù)雜心血管癥狀，其中高鹽攝入是最重要的環(huán)境因素之一。所謂血壓的鹽敏感性是指相對(duì)高鹽攝入所引起的血壓升高，它帶來的危害不僅僅是升高血壓，還能夠引發(fā)腦卒中、心衰、動(dòng)脈粥樣硬化等并發(fā)癥，并可加重胰島素抵抗等。研究表明，鹽敏感性高血壓病人并發(fā)心腦血管事件的風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于鹽耐受性高血壓病人[2]。西方發(fā)達(dá)國家一般人群中血壓鹽敏感者約 26%，而原發(fā)性高血壓群體中血壓鹽敏感者約 51%；我國一般人群中血壓鹽敏感者 20%-30%，而原發(fā)性高血壓群體中血壓鹽敏感者占 50-60%。因此，有效控制鹽敏感性高血壓對(duì)于改善我國人群健康具有重要的意義。

鹽敏感性高血壓的病理機(jī)制表現(xiàn)為鈉離子吸收增多或者腎臟重吸收異常導(dǎo)致鈉水潴留。目前抗高血壓藥物主要通過舒張血管和利尿改善鈉水代謝的機(jī)制降低機(jī)體血壓，并且利尿藥物作為臨床用藥的首選藥物，但仍有一定比例的患者沒能達(dá)到控制目標(biāo)。機(jī)體鈉代謝的調(diào)節(jié)包括機(jī)體通過消化系統(tǒng)對(duì)鈉的吸收和通過腎臟對(duì)鈉的排出，目前高血壓治療的臨床藥物和對(duì)高血壓與鈉水代謝的研究主要集中在腎臟對(duì)鈉水代謝的調(diào)節(jié)，而通過消化系統(tǒng)抑制機(jī)體鈉的吸收可能是從根本上解決鹽敏感性高血壓的重要手段。本動(dòng)物模型將在前期研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，探索胃泌素抑制腸道對(duì)鈉的吸收，及其在調(diào)節(jié)鈉水代謝及鹽敏感性高血壓中的重要作用，為鹽敏感高血壓的防治提供可靠的新模型和行之有效的新思路。

二、模型背景

1、造模因素信息

腸道CCKBR基因條件性敲除小鼠模型

2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背景信息

C57BL/6小鼠

3、研究背景

胃泌素(Gastrin)是一種重要的胃腸激素，它主要由胃和十二指腸G細(xì)胞分泌產(chǎn)生。胃泌素除調(diào)節(jié)胃腸道的分泌功能外，還能夠?qū)σ认佟⑿∧c、肝臟、腎臟、卵巢等器官有重要的生理調(diào)節(jié)作用[1]。編碼 Gastrin 的基因定位于人類17號(hào)染色體(17q21)上。GWAS分析發(fā)現(xiàn)，胃泌素及其受體 CCKBR（Cholecystokinin B Receptor）所在的遺傳位點(diǎn)與高血壓密切相關(guān)[2,3]。胃泌素受體基因敲除小鼠鈉水代謝障礙，同時(shí)伴有血壓顯著升高[4]。我們首次通過人群試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高血壓人群餐后胃泌素水平都明顯高于正常人群[5]。胃泌素受體CCKBR基因敲除小鼠（CCKBR-/-）和野生型對(duì)照小鼠，分別給予高鹽飲食（6%NaCl）和正常鹽飲食（0.4% NaCl），發(fā)現(xiàn) CCKBR-/-小鼠高鹽飲食后血壓顯著升高[6]。胃腸道鈉水失衡能夠誘發(fā)多種疾病，如高血壓、心衰和腎病等。已有研究顯示通過消化系統(tǒng)抑制機(jī)體鈉的吸收可能是從根本上解決鹽敏感性高血壓的重要手段。

我們?cè)O(shè)計(jì)制構(gòu)建的CCKBR基因腸道上皮細(xì)胞特異性敲除小鼠(CCKBRfl/fl;Villin Cre)，通過正常鹽喂養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)該小鼠血壓明顯升高，而對(duì)照 CCKBRfl/fl小鼠血壓正常。該模型對(duì)于研究腸道靶向藥物治療鹽敏感性高血壓有研究意義。

參考文獻(xiàn)

1.Koh TJ. Extragastriceffects of gastrin gene knock-out mice. Pharmacology & Toxicology. 2002; 91:368-74.

2.Levy D, Ehret GB, RiceK, et al. Genome-wide association study of blood pressure andhypertension. Nat Genet. 2009; 41: 677-87.

3. Cho YS, Go MJ, KimYJ, et al. A large-scale genome-wide association study of Asian populationsuncovers genetic factors influencing eight quantitative traits.

Nat Genet. 2009; 41:527-34.

4. von Schrenck T,Ahrens M, de Weerth A, et al. CCKB/gastrin receptors mediate changes in sodium andpotassium absorption in the isolated perfused rat kidney.

Kidney Int. 2000; 58:995-1003.

5. Jiang X, Wang W, NingB, Yang H, Liu X, Gong J, Gan F, Gao X, Zhang L, Jose PA, Yang Z. Basal andpostprandial serum levels of gastrin in normotensive and

hypertensive adults.Clin Exp Hypertens. 2013; 35(1):74-81.

6. Jiang X, Chen W, Liu X,Wang Z, Liu Y, Felder RA, Gildea JJ, Jose PA, Qin C, Yang Z. Thesynergistic roles of cholecystokinin B and dopamine D5

receptors on theregulation of renal sodium excretion. PLoS One. 2016;11:e0146641