IFITM6敲除小鼠模型

該模型的鑒與評(píng)價(jià)技術(shù)方法和指標(biāo)體系包括（1）分子水平：模型鼠基因型及mRNA表達(dá)應(yīng)符合5.1和5.2中指標(biāo)要求。（2）細(xì)胞水平：該基因過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖影響應(yīng)符合5.3中指標(biāo)要求。（3）整體水平：模型小鼠造血干細(xì)胞對(duì)TBI和競(jìng)爭(zhēng)性移植的影響應(yīng)符合5.4、5.5中指標(biāo)要求。。

在病毒感染引起的先天性免疫應(yīng)答，IFITM家族在其中起重要作用，但是關(guān)于該家族在其他方面的研究相對(duì)較少。通過(guò)前期的大數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)IFIMT6可能在造血干細(xì)胞的發(fā)育分化、衰老過(guò)程中發(fā)揮作用，為探明該基因在造血干細(xì)胞中的作用和機(jī)制，我們建立了該基因的敲除小鼠模型，通過(guò)初步研究發(fā)現(xiàn)該基因缺失，在正常情況下，分析造血干細(xì)胞分化發(fā)育的各譜系細(xì)胞，并未發(fā)現(xiàn)明顯差異，但是在TBI引起的造血干細(xì)胞損傷中起保護(hù)作用，并且通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性移植實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該基因缺失，能夠增強(qiáng)其競(jìng)爭(zhēng)性能力，表明該基因缺失可能在外界刺激的情況下起保護(hù)作用，但是具體機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。

該基因敲除小鼠模型的建立，為該基因功能研究、病毒引起的先天性免疫應(yīng)答研究、造血干細(xì)胞的功能研究等提供動(dòng)物模型支撐。

模型制作及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中涉及動(dòng)物的操作程序已獲得中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為ZLF18004。本實(shí)驗(yàn)部分使用了基因修飾動(dòng)物（基因敲除），只在規(guī)定的SPF級(jí)動(dòng)物設(shè)施內(nèi)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)過(guò)程有防逃逸的措施，如擋鼠板等。動(dòng)物在離開動(dòng)物設(shè)施后，進(jìn)行完相關(guān)試驗(yàn)后，立即進(jìn)行處死，取材。動(dòng)物尸體暫存于-20℃冰箱中，經(jīng)有資質(zhì)的公司運(yùn)走統(tǒng)一處理。

4.1 IFITM6主要定位于細(xì)胞膜上 構(gòu)建過(guò)表達(dá)IFITM6-Flag質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，通過(guò)用抗Flag抗體進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果表明IFITM6主要定位于細(xì)胞膜上（圖3A）。并對(duì)K562細(xì)胞中家族其他基因分析，發(fā)現(xiàn)IFITM1和IFITM2表達(dá)相對(duì)較高（圖3B），IFITM6過(guò)表達(dá)影響細(xì)胞增殖（圖3C）

圖3所示 在K562細(xì)胞中過(guò)表達(dá)影響細(xì)胞增殖

4.2 IFITM6敲除小鼠的建立

利用CRISPR/Cas9在IFITM6基因第二外線子選擇gRNA靶點(diǎn)，敲除第二外顯子。出生的小鼠經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)包含靶點(diǎn)的引物（Table1），進(jìn)行基因型鑒定，并進(jìn)行插入序列的測(cè)序，最終獲得了敲除第二外顯子的小鼠，如圖3-a所示。隨后，我們通過(guò)雜合子雜交的方式獲得了純合敲除小鼠，并進(jìn)行了表達(dá)分析，圖3-c顯示。結(jié)果表明我們成功建立了該基因的敲除小鼠模型。

圖3 IFITM6敲除小鼠的建立

Table 1 本文中用于基因型鑒定的引物信息

4.3 IFITM6敲除對(duì)家族其他成員的影響

我們分析了IFITM6敲除對(duì)家族其他成員的影響，結(jié)果表明IFIMT6敲除小鼠中，IFITM1表達(dá)升高，IFITM2和IFITM5表達(dá)下降，IFITM3表達(dá)變化不明顯（圖4所示）。

圖4 IFIMT6敲除對(duì)IFIMT家族其他成員表達(dá)的影響

4.4 IFITM6敲除影響LT-HSC

我們對(duì)該基因的敲除小鼠進(jìn)行了造血干細(xì)胞分化、發(fā)育相關(guān)的流式分析，結(jié)果表明基因缺失對(duì)LSK影響不明顯，但對(duì)LT-HSC有促進(jìn)作用，但是LT單克隆培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，敲除后會(huì)造成克隆形成數(shù)減少，但不影響克隆大小和形態(tài)（圖5所示）。

圖5 IFITM6敲除影響HSC功能

4.5 IFITM6敲除在輻射引起的損傷（TBI）中起保護(hù)作用

我們對(duì)該基因敲除小鼠進(jìn)行了輻射引起的損傷（TBI）實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示IFITM6敲除在TBI實(shí)驗(yàn)中起保護(hù)作用，并且克隆形成能力明顯增加（圖5所示）。

圖6 IFITM6敲除在TBI實(shí)驗(yàn)中起保護(hù)作用

4.6 IFITM6敲除影響骨髓競(jìng)爭(zhēng)性移植

我們通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性移植實(shí)驗(yàn)，初步分析發(fā)現(xiàn)，IFITM6敲除在競(jìng)爭(zhēng)性移植中起保護(hù)作用（圖7所示）。由于動(dòng)物目前數(shù)量較少，需要進(jìn)一步增加動(dòng)物數(shù)量進(jìn)一步核實(shí)。

圖7 競(jìng)爭(zhēng)性移植實(shí)驗(yàn)

5.1基因型鑒定

該模型鼠是通過(guò)CRISPR技術(shù)，將IFITM6的第二外顯子敲除，，因此，在基因水平鑒定，需要區(qū)分野生型、雜合子和純合子，鑒定引物為Table1中所列。

5.2基因表達(dá)情況

對(duì)敲除鼠組織取材，通過(guò)Q-PCR檢測(cè)檢測(cè)不到IFITM6基因的表達(dá)。

5.3 過(guò)表達(dá)K562細(xì)胞增殖的影響

該基因的表達(dá)主要定位于細(xì)胞膜上，過(guò)表達(dá)會(huì)影響K562細(xì)胞的增殖。

5.4 在TBI中的作用

該基因敲除在TBI引起的造血干細(xì)胞損傷過(guò)程中起保護(hù)作用。

5.5 該基因敲除對(duì)競(jìng)爭(zhēng)性移植的影響

該基因敲除后，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性移植實(shí)驗(yàn)，敲除細(xì)胞在受體鼠中占具數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)。

3.1 實(shí)驗(yàn)材料

3.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司 SCXK(京）2016-0006。超排用雌鼠數(shù)量10-15只，年齡3周齡，交配傳代用野生型鼠為成年8-10周齡小鼠。實(shí)驗(yàn)中基因工程小鼠由本實(shí)驗(yàn)室繁殖產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)中涉及動(dòng)物的操作程序已獲得中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為ZLF18004.

3.1.2實(shí)驗(yàn)儀器

3.1.3實(shí)驗(yàn)試劑

3.1.4 模型構(gòu)建流程 利用CRISPR/Cas9技術(shù)制備IFITM6敲除小鼠。選擇敲除第二外顯子，來(lái)構(gòu)建IFITM6敲除小鼠 (B6. IFITM6 (tm)-GC/ILAS)。該基因敲除的雜合子小鼠，相互雜交可以獲得該基因敲除的純合子小鼠，使用PCR方法進(jìn)行基因型鑒定。3.1.5 IFITM6敲除小鼠的建立3.1.5.1 IFITM6敲除小鼠模型的建立(1) 設(shè)計(jì)方案

(2) 構(gòu)建sgRNA 載體pUC57-sgRNA expressionvector，根據(jù)基因信息選擇靶點(diǎn)并合成sgRNA。

靶點(diǎn)1:

M-Ifitm6-EA1-g-up: TAGGACTGGGATCTGGTATAGG

M-Ifitm6–EA1-g-down: AAACCCTATACCAGATCCCAGT

靶點(diǎn)2:

M-Ifitm6-EB1-g-up: TAGGGAGAATGCCCAGGGATTC

M-Ifitm6–EB1-g-down: AAACGAATCCCTGGGCATTCTC合成的sgRNA單鏈通過(guò)退火復(fù)性結(jié)合成小片段，插入BSA I線性化的載體，構(gòu)建完成的sgRNA載體通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄成為可注射的sgRNA。

(3) 構(gòu)建Cas9載體pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，載體通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄成為可注射的Cas9-RNA。

(4) 顯微注射

1) 超數(shù)排卵：10-15只3周齡雌鼠注射激素進(jìn)行超排。

2) 受精卵注射：取約120枚受精卵進(jìn)行注射。

3) 受體鼠制備：8-10周齡雌鼠與結(jié)扎的SD雄鼠交配后選取見栓的雌鼠。

4) 胚胎移植：將注射后的受精卵移植到受體鼠輸卵管壺腹部（移植一次，120枚卵，5只受體鼠）。

(5) 基因型鑒定

1) 剪尾編號(hào)：出生7-10天的乳鼠，剪取腳趾和尾尖進(jìn)行編號(hào)及取材。

2) 基因組DNA提取：使用基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA

3) PCR檢測(cè)：根據(jù)序列信息設(shè)計(jì)檢測(cè)引物并進(jìn)行PCR檢測(cè)。

(6) 結(jié)果分析：選取通過(guò)PCR檢測(cè)后含有不同于野生型分子量條帶的鼠號(hào)，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆，之后用檢測(cè)引物進(jìn)行菌液PCR，篩選有插入的克隆測(cè)序。

(7) 根據(jù)測(cè)序結(jié)果確定IFITM6敲除小鼠模型(B6.IFITM6 (tm)-GC/ILAS)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.1.5.2 動(dòng)物繁殖和表達(dá)圖譜分析

獲得F0代后，首先通過(guò)與野生型鼠進(jìn)行雜交，進(jìn)行基因修飾鼠傳代能力分析。獲得能夠傳代的雜合子小鼠進(jìn)行相互雜交，產(chǎn)生純合敲除小鼠并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖 2. IFITM6敲除小鼠的繁育

3.1.5.3 鼠尾基因組DNA提取

在幼崽出生后剪腳趾標(biāo)記，收集幼崽腳趾至1.5 mL EP管。然后參照DNA提取試劑盒（全式金）說(shuō)明書按以下程序操作。

(1) 加入100μL LB2和20 μL Proteinase K，55℃搖床孵育至完全裂解。

(2) 12000rpm 離心5min，轉(zhuǎn)移上清于一無(wú)菌的離心管中。

(3) 加入500μLBB2，立即渦旋5s，室溫孵育10min。

(4) 將全部的溶液加入離心柱中，8000rpm離心1min，棄掉流出液。

(5) 加入500μL CB2溶液，12000 rpm離心1min，棄掉流出液。

(6) 重復(fù)步驟（5）一次。

(7) 加入500μL WB2（使用前加入88 mL無(wú)水乙醇），12000rpm 離心1min，棄掉流出液。

(8) 重復(fù)步驟（7）一次。

(9) 10000rpm 離心2min，徹底去除殘留的WB2。

(10) 將離心柱置于一干凈的離心管中，開蓋靜置5min，在柱的中央加入50~200μL預(yù)熱EB（60℃~70℃），蓋上蓋子，室溫靜置3min，12000rpm 離心2min，洗脫DNA。保存至4℃冰箱。

一、疾病概述

固有免疫是機(jī)體防御外來(lái)病毒感染的第一道防線，通過(guò)識(shí)別病原并產(chǎn)生各種細(xì)胞因子、趨化因子、干擾素（IFN）等多種抗病毒因子。干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白（IFITM家族），是一類具有抗病毒作用的ISG（干擾素誘導(dǎo)基因）的編碼產(chǎn)物，并證明其在多種生物過(guò)程中發(fā)揮作用，具有廣泛的抗病毒作用，并在免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞歸巢等發(fā)揮作用。

IFITM家族包括IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5、IFITM6、IFITM7和IFITM10，除了IFITM5特異性表達(dá)與骨細(xì)胞，不依賴與IFN的表達(dá)，其余家族在IFN的調(diào)控下在多組織和器官?gòu)V泛表達(dá)。其中，F(xiàn)ITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5和IFITM10在人類中表達(dá)，F(xiàn)ITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5和IFITM6在小鼠中表達(dá)（圖1）。

圖1 IFITM家族成員 （a）人和小鼠的IFITM家族成員差異比較（b）IFITM家族的跨膜形式。

IFITM家族具有兩個(gè)輸水區(qū)，被一個(gè)稱為保守型細(xì)胞內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)（CTL）保守區(qū)分開。IFITM在不同組織和細(xì)胞中，分布相對(duì)廣泛。IFITM1主要位于細(xì)胞膜和早期內(nèi)體，能夠與細(xì)胞表面分子CD19和CD81相互作用。報(bào)道顯示CD81是HCV的受體，表明IFITM1可能與HCV感染進(jìn)入細(xì)胞存在相關(guān)性。IFITM2和IFITM3主要存在于晚期內(nèi)體和溶酶體，并于Ras相關(guān)蛋白R(shí)AB7、CD63和LAMP1共定位。通過(guò)功能基因組篩選，發(fā)現(xiàn)IFIMT1、IFIMT2、 IFIMT3，能夠被1型和2型IFN誘導(dǎo)表達(dá)，并對(duì)于IFN抑制流感性病毒發(fā)揮重要作用。IFITM3基因敲除小鼠模型，在感染流感病毒后引起爆發(fā)性病毒肺炎，重新基于IFIMI3可以逆轉(zhuǎn)病情。已有的研究還表明IFIMT家族還參與Th1和Th2細(xì)胞的分化調(diào)節(jié)（圖2所示）。IFIMT5參與成骨細(xì)胞和礦物鹽沉積。IFITM10在不同物種中的同源非常高，高達(dá)85%以上，但是功能仍是未知。通過(guò)敲除小鼠的IFITM3, IFITM5，和IFITM 6基因后，發(fā)現(xiàn)能夠影響Th1細(xì)胞的分化，但是IFITM6的具體功能仍不清楚。

圖2 IFTIM家族參與Th1和Th2的分化調(diào)節(jié)

IFITM作為固有免疫系統(tǒng)IFN效應(yīng)的重要元件，在病毒性疾病的防御過(guò)程中發(fā)揮重要作用。由于IFITM參與調(diào)節(jié)機(jī)體的固有免疫，在病毒引起的疾病機(jī)制中具有重要作用。IFITM敲除的小鼠在Th2設(shè)計(jì)的免疫病理和應(yīng)答中起保護(hù)作用。IFITM家族作為抗病毒治療的有效靶點(diǎn)，能夠抑制病毒入胞和復(fù)制，這對(duì)病毒感染相關(guān)疾病的預(yù)防和治療提供可能的新的藥物靶點(diǎn)。

1、基因信息

干擾素誘導(dǎo)膜蛋白6（interferon induced transmembrane protein 6 ，Ifitm6，GENE ID：213002），由IFITM6基因所編碼，功能不明確，可能在Th2細(xì)胞的分化過(guò)程中起作用。

細(xì)胞：K562細(xì)胞（人類紅白血病細(xì)胞系），源自一個(gè)53歲的女性慢性髓性白血病爆發(fā)期病人的淋巴母細(xì)胞。293T細(xì)胞，人腎上皮細(xì)胞系，同時(shí)表達(dá) SV40 大 T 抗原。

2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背景信息

實(shí)驗(yàn)所用小鼠（C57BL/6）背景。C57BL/6小鼠也被稱為C57 black6，也稱作B6。1921年被培育出來(lái)，屬于近交品系。該品系的最主要的兩個(gè)特點(diǎn)就是品系穩(wěn)定和易于繁殖。主要用途包括：作為生理學(xué)與病理學(xué)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型、構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型、作為產(chǎn)生自發(fā)突變和誘發(fā)突變的同基因型小鼠的背景品系。該品系在國(guó)內(nèi)使用頻率高，價(jià)格相對(duì)便宜。

3、研究背景

在固有免疫系統(tǒng)中，IFITM作為固有免疫系統(tǒng)IFN效應(yīng)的重要元件，在病毒性疾病的防御過(guò)程中發(fā)揮重要作用。除在固有免疫系統(tǒng)中發(fā)揮作用，IFITM家族還參與其他生理功能，如IFIMT5參與成骨細(xì)胞和礦物鹽沉積。我們?cè)谇捌诠ぷ髦校ㄟ^(guò)造血干細(xì)胞的高通量測(cè)序和表達(dá)分析，篩選到基因IFITM6，表明該基因可能在造血干細(xì)胞的相關(guān)的生物學(xué)功能中發(fā)揮作用。IFITM6在小鼠造血干細(xì)胞中是否發(fā)揮作用，以及擁有怎樣的生物學(xué)功能，需要進(jìn)一步研究進(jìn)行闡述。

目前尚沒(méi)有IFITM6的基因敲除小鼠，構(gòu)建該基因的敲除小鼠，分析該基因敲除后的表型以及在造血干細(xì)胞中的功能，該項(xiàng)目不僅為該基因在造血干細(xì)胞中的功能提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)也為該基因在病毒感染的先天性免疫機(jī)制研究中提供動(dòng)物模型。

參考文獻(xiàn)：

【1】Yánez DC, Ross S, Crompton T. The IFITM protein family in adaptive immunity.Immunology. 2020 Apr;159(4):365-372. doi: 10.1111/imm.13163. Epub 2019 Dec 22.

【2】Yánez DC, Sahni H, Ross S, Solanki A, Lau CI, Papaioannou E,Barbarulo A, Powell R, Lange UC, Adams DJ, Barenco M, Ono M, D'Acquisto F,Furmanski AL, Crompton T. IFITM proteins drive type 2 T helper celldifferentiation and exacerbate allergic airway inflammation. Eur J Immunol.2019 Jan;49(1):66-78. doi: 10.1002/eji.201847692. Epub 2018 Nov 9.

【3】Smith S, Weston S, Kellam P, Marsh M. IFITM proteins-cellularinhibitors of viral entry. Curr Opin Virol. 2014 Feb;4:71-7. doi:10.1016/j.coviro.2013.11.004. Epub 2014 Jan 28.

【4】Shi G, Ozog S, Torbett BE, Compton AA. mTOR inhibitors lower an intrinsicbarrier to virus infection mediated by IFITM3. Proc Natl Acad Sci US A. 2018 Oct 23;115(43):E10069-E10078. doi: 10.1073/pnas.1811892115. Epub 2018Oct 9.

【5】Li K, Markosyan RM, Zheng YM, Golfetto O, Bungart B, Li M, Ding S,He Y, Liang C, Lee JC, Gratton E, Cohen FS, Liu SL. IFITM proteins restrictviral membrane hemifusion. PLoS Pathog. 2013 Jan;9(1):e1003124. doi:10.1371/journal.ppat.1003124. Epub 2013 Jan 24.

【6】Zhao X, Li J, Winkler CA, An P, Guo JT. IFITM Genes, Variants, and Their Roles in the Control andPathogenesis of Viral Infections. FrontMicrobiol. 2019 Jan 8;9:3228. doi: 10.3389/fmicb.2018.03228. eCollection 2018.

【7】Hickford D, Frankenberg S, Shaw G,Renfree MB. Evolution of vertebrate interferon inducible transmembraneproteins. BMC Genomics. 2012 Apr 26;13:155. doi: 10.1186/1471-2164-13-155.

【8】Rodriguez Celin M, Moosa S, Fano V. UncommonIFITM5 mutation associated with severe skeletal deformity in osteogenesisimperfecta. Ann Hum Genet. 2018 Nov;82(6):477-481. doi: 10.1111/ahg.12275. Epub2018 Jul 24.

【9】Lazarus S, McInerney-Leo AM, McKenzie FA, Baynam G, Broley S, CavanBV, Munns CF, Pruijs JE, Sillence D, Terhal PA, Pryce K, Brown MA, Zankl A,Thomas G, Duncan EL. The IFITM5 mutation c.-14C > T results in an elongatedtranscript expressed in human bone; and causes varying phenotypic severity ofosteogenesis imperfecta type V. BMC Musculoskelet Disord. 2014 Mar 27;15:107.doi: 10.1186/1471-2474-15-107.

【10】Hanagata N, Li X, Morita H, Takemura T, Li J, Minowa T. Characterizationof the osteoblast-specific transmembrane protein IFITM5 and analysis ofIFITM5-deficient mice. J Bone Miner Metab. 2011 May;29(3):279-90. doi:10.1007/s00774-010-0221-0. Epub 2010 Sep 14.