柯薩奇病毒A10型灌胃感染小鼠模型

本課題組采用7日齡ICR乳鼠、經灌胃CA10病毒的感染途徑，成功獲得CA10病毒灌胃感染小鼠模型。模型建立過程中采用臨床評分標準對感染后動物的臨床癥狀進行評價，并記錄死亡率和體重情況；采用熒光定量PCR-標準曲線法對感染后動物血液和組織中的病毒載量進行測定，以確定病毒的復制情況；采用HE染色法對組織切片進行病理觀察，確定組織病變情況。

本CA10病毒灌胃感染小鼠模型與文獻報道的泰山醫學院的史衛峰教授課題組的ICR乳鼠肌肉注射感染模型，都采用國際通用的封閉群ICR小鼠的乳鼠作為感染對象，都得到了具有典型神經系統病癥的小鼠感染重癥模型。在感染5天后動物出現明顯的臨床癥狀，包括駝背或炸毛，后肢無力，單后肢癱瘓，雙后肢癱瘓，第7天觀察到動物死亡；之后幾日臨床評分不斷升高，最終大部分感染小鼠死亡（觀察期結束時死亡率為80%）。采集感染小鼠的血液和后肢肌肉組織樣本，檢測到病毒載量從第1天的低于檢測水平（<200 copies/ul）上升到第3天的高水平（>106 copies/μl），說明病毒在機體內的大量復制擴增；尤其是在肌肉組織中病毒載量的結果與臨床癥狀相吻合。采集感染小鼠第5天心、肝、脾、肺、腎、小腸、胸腺、腦組織，檢測病毒載量在檢測閾值之上，說明除了肌肉組織CA10病毒也能在其他組織中進行復制，并在脾臟、胸腺和腦組織中觀察到了相應病變；尤其腦組織中的病變與重癥患者的腦炎癥狀接近。

本模型與文獻模型的不同之處在于：使用的病毒株不同，來自于不同病人的臨床分離株；小鼠的日齡不同，我們使用7日齡的ICR乳鼠，相對于5日齡小鼠更易于操作；感染途徑不同，我們采用灌胃感染的方式，而非采用肌肉注射感染方式，更接近于病毒糞口傳播的自然感染途徑，有利于觀察和研究CA10病毒的自然感染機制、嗜肌性以及對其他組織的損傷。

CA10病毒灌胃感染模型的建立需要確定乳鼠的日齡和感染的劑量。由于CA10病毒對5歲以下兒童易感，相應的CA10病毒也只能使乳鼠在感染后表現出癥狀。我們試驗了7日齡和10日齡的乳鼠，發現10日齡乳鼠感染后癥狀表現不穩定，因此選取了7日齡乳鼠作為感染動物。對于病毒感染劑量，我們也嘗試了106、107、108 TCID50，選擇了癥狀更為合適和穩定的107 TCID50。

由于CA10病毒主要通過糞口傳播，在自然感染狀態下是經胃腸道侵入機體的，因此通過灌胃感染途徑得到的動物模型更接近于疾病自然發生的狀態。課題組在原有CA1小鼠腹腔注射感染模型的基礎上，通過灌胃方式建立的小鼠感染模型，為研究病毒的感染機制和機體免疫反應提供研究基礎，也完善了應用于藥物和疫苗開發實驗的模型種類。

CA10病毒在人間傳染病名錄中屬于第三類，涉及的實驗需在BSL-2實驗室進行，動物實驗在ABSL-2實驗室開展。CA10病毒已經過風險評估，具有相應標準操作程序。

CA10病毒對5歲以下兒童易感，主要通過糞口傳播，對于具有BSL-2防護裝備的實驗人員危害較小；實驗人員均經過生物安全培訓獲得證書；進入動物房之前，穿戴防護服、口罩、帽子、鞋套，防護眼鏡等進行防護；實驗結束后按要求去除防護設備集中處理。

成年ICR小鼠對CA10病毒不敏感，21日齡ICR小鼠在感染大劑量病毒后仍能自愈。對于感染動物的排泄物進行檢測，在少數糞便樣本中檢測到少量病毒，載量約為2X102~103copies/mg；因此需對墊料等接觸動物糞便的物品按要求進行高壓滅菌處理。

動物感染病毒后取得的血液和組織直接放入核酸裂解液或組織固定液，滅活病毒。所有涉及到的相關污染物如離心管、灌胃針、手術剪、手術鑷和毒株等將統一高溫高壓消毒后集中處理。

動物實驗操作均在ABSL-2動物房的生物安全柜中進行，實驗后將病毒毒株、動物尸體、尿墊等包裝好進行高壓滅菌處理，注射器放入利器桶處理。

1. 臨床癥狀表型：

7日齡ICR小鼠感染CA10病毒5天后，開始出現不同程度的臨床癥狀，癥狀由輕到重包括：駝背或炸毛，后肢無力，單后肢癱瘓，雙后肢癱瘓，嚴重的直至死亡。第7天感染小鼠出現死亡，此后臨床癥狀評分持續升高，持續出現小鼠死亡現象。到觀察期結束（感染后12天）時平均臨床評分為4分，存活率為20%（圖1A，1B）。不過，感染小鼠體重增加未出現顯著減緩，尤其是前10天基本與正常小鼠一致（圖1C）。

圖1. ICR 7日齡乳鼠灌胃感染CA10病毒后癥狀觀察。A，感染后乳鼠的存活率時間變化曲線； B，感染后乳鼠的臨床癥狀評分時間變化曲線； C，感染后乳鼠體重隨時間變化曲線。

2. 血液和組織中病毒復制情況：

感染后第1天血液和肌肉組織中病毒載量都低于檢測閾值。到第3天血液中病毒載量均值達到4.6 X 106 copies/μl，第5天時則下降至4X105copies/μl（圖2A）。后肢肌肉的病毒載量在感染后第3天為1.9X107 copies/mg，第5天繼續上升至1.1X108 copies/mg（圖2B）。除肌肉組織外，在其他組織樣本中也都能檢測到CA10病毒RNA，其中肝臟中的病毒載量最高，最高值可達105 copies/mg（圖2C）。心臟、腎臟、小腸和大腦中的病毒載量都超過了104 copies/mg；脾臟、肺和胸腺病毒復制比較少，都低于104 copies/mg。

圖2. ICR 7日齡乳鼠灌胃感染CA10病毒后血液和組織中病毒載量情況。A，感染后第3天和第5天血液中病毒載量情況； B，感染后第3天和第5天后肢肌肉組織中病毒載量情況；C，感染后第5天心、肝、脾、肺、腎、小腸、胸腺和腦組織中病毒載量情況。

3. 病理變化情況：

CA10病毒具有明顯的嗜肌性，感染小鼠后肢肌肉中的病毒載量最高，且感染后的臨床癥狀也表現為后肢的癱瘓癥狀，病理結果分析發現：骨骼肌病理損傷嚴重，具體表現為骨骼肌細胞變性壞死、大量炎細胞浸潤（圖3A）。除后肢肌肉外，在脾臟、胸腺和腦組織中也能觀察到明顯的病理變化：脾臟中能觀察到白髓萎縮，伴有巨噬細胞吞噬凋亡淋巴細胞形成的星空現象（圖3B）；胸腺組織切片出現皮質變薄，淋巴細胞凋亡及壞死等病理損傷（圖3C）；腦組織局部神經元周五和網狀神經氈可見空泡，少數神經元發生固縮現象（圖3D）。其他組織，包括心臟、肝臟、肺、腎、小腸組織均未見明顯病理損傷。

圖3. ICR7日齡乳鼠感染CA10病毒后組織病理變化情況。A-D，感染后第5天后肢骨骼肌、脾臟、胸腺、腦組織病理切片情況； E-H，正常小鼠的后肢骨骼肌、脾臟、胸腺、腦組織正常對照。（HE染色，A&E標尺=100μm，B-D&F-H標尺=200μm）

（一）模型評價方法：

1. 臨床癥狀觀察：

動物感染CA10病毒后觀察10天，每天記錄體重變化、癥狀和死亡率。根據癥狀嚴重程度，參照以下標準低動物進行臨床評分打分：

0：未見異常；

1：駝背或炸毛；

2：后肢遲緩無力；

3：單后肢癱瘓；

4：雙后肢癱瘓；

5：死亡。

2. CA10病毒載量測定方法：實時熒光定量PCR技術-標準曲線法。

2.1取樣：分別在感染后第1天、第3天、第5天處死動物，采集血液100ul和后肢肌肉組織樣本50mg，感染第5天采集心、肝、脾、肺、腎、小腸、胸腺、腦組織，放入Trizol中；

2.2 RNA提取：采用Trizol法提取血液和組織中的RNA；

2.3 一步法熒光定量PCR檢測病毒核酸濃度：

（1）特異性引物和Taqman探針：

Forwardprimer：GAAATGGRGTGTTGGAAACCA，

Reverseprimer：TTTCTGCGRAGTTGGACAAAG，

Probe:FAM-ATCAACCAYTTCTTCTCYCGCTCTGG-TAM；

（2）標準品：合成的CA10病毒核酸片段，濃度梯度為：2X109copies/μl、2X108copies/μl、2X107copies/μl、2X106copies/μl、2X105copies/μl、2X104copies/μl、2X103copies/μl、2X102copies/μl。共8個稀釋梯度，每個濃度做3個重復。

（3）陰性對照和陽性對照：陰性對照用水代替核酸樣本；陽性對照采用CA10病毒儲液提取得到的核酸；

（4）熒光定量PCR試劑盒：Qiagen RNeasy Mini Kit（貨號:74106），根據試劑盒要求準備反應體系；

（5）反應條件：①反轉過程：50℃ 30min；②PCR過程：95℃ 15min；94℃ 15s，60℃ 60s，該步驟循環數為40；

（6）實驗儀器：ABI Q3熒光定量PCR儀

（7）結果分析：①反應結果應同時符合以下條件，否則實驗結果無效。

陰性對照：無擴增，為陰性。

②標準曲線：標準曲線R2大于0.95可用，若低于0.95數據不可用，則需重新測定；

③結果判斷：根據標準曲線計算出CA10病毒的載量。病毒載量的檢測閾值為2X102 copies/μl，低于該數值的結果不可信。

3. 病理分析：HE染色

蘇木精—伊紅染色法（hematoxylin-eosin?staining，H&E）是石蠟切片中常用的染色方法：其中蘇木精染液呈堿性，可將嗜堿性的細胞核及細胞內核糖體染成藍紫色；伊紅染液呈酸性，將嗜酸性的細胞質及細胞外基質染成紅色。

ICR小鼠灌胃感染CA10病毒5天后，取后肢骨骼肌、心、肝、脾、肺、腎、小腸、胸腺、腦置于10%福爾馬林中固定72 h，經梯度酒精脫水后將其包埋在石蠟中，切片得到的石蠟切片厚度為 5 μm，隨后進行H&E染色，最后在光學顯微鏡下觀察組織病理變化。

（二）評價指標：

1. 臨床癥狀評價：CA10病毒灌胃感染成功模型應具有典型的神經系統癥狀，即可觀察到動物的重癥肌無力表型，包括單后肢或雙后肢癱瘓。根據臨床評分標準，在灌胃感染CA10病毒觀察期（12天）內，第5天可觀察到臨床癥狀，且癥狀持續加重、評分持續升高；第7天出現死亡，但死亡率低于腹腔注射感染，后者在觀察期內全部死亡。

2. 血液和組織中病毒復制情況評價體系：動物在灌胃感染CA10病毒后第1天、第3天、第5天采集血液和后肢肌肉組織樣本，在第5天采集心、肝、脾、肺、腎、腦、胸腺組織，測定其中的病毒載量。經灌胃感染CA10病毒后，第1天病毒載量都低于檢測閾值。CA10病毒首先在血液中復制達到較高水平，第3天的檢測值在106 copies/μl以上，而到第5天血液中病毒載量出現下降，檢測值在105 copies/μl水平；而在后肢肌肉組織中，CA10病毒載量由第3天的106~107 copies/mg上升到107~108 copies/mg，說明病毒在肌肉中發生了大量擴增，具有典型的嗜肌性，與臨床癥狀表現相吻合。在其他組織中，病毒載量大部分在檢測閾值之上。

3. 病理評價體系：CA10病毒具有明顯的嗜肌性，灌胃感染小鼠后肢肌肉中的病毒載量最高，臨床癥狀也表現為后肢癱瘓，在病理結果上同樣可見骨骼肌病理損傷嚴重，骨骼肌細胞變性壞死、且出現大量炎癥細胞浸潤。除后肢肌肉外，在脾臟、胸腺和腦組織中也能觀察到明顯的病理變化，尤其是腦組織局部神經元周五和網狀神經氈可見空泡，少數神經元發生固縮現象，說明在小鼠CA10灌胃感染模型中也能出現神經性病變。

1.病毒準備：CA10病毒(GenBank: MF688814.1)，由醫院咽拭子分離得到，在人橫紋肌瘤細胞（RD）中培養、擴增，并采用反復凍融法釋放病毒，離心富集病毒。

（1）細胞病毒培養操作：

RD細胞經常規傳代培養接種到T75細胞培養瓶，培養至融合度約80%；感染前棄去原培養基，細胞用含2%雙抗的PBS洗2遍，吸出PBS后加入無血清DMEM培養基。接種適量的CA10病毒后，置于37℃ 5%CO2培養箱孵育1~2h；之后棄去無血清培養基，加入完全培養基繼續培養。接種病毒后2~3d細胞病變CPE達到+++～++++，將T75細胞瓶置封口袋中，-80℃超低溫冰箱凍化3次。然后將培養液轉移至50mL離心管中，4℃ 2000rpm離心20min，沉淀細胞碎片。吸取病毒上清，分裝后凍存，并測定病毒滴度TICD50。

（2）組織病毒培養操作：

將CA10病毒以肌肉點注方式感染10日齡ICR乳鼠，三天后取肌肉組織置于適量PBS中研磨均勻，3000rpm離心30min，上清即為病毒液，分裝后置于-80℃冰箱保存。

2.實驗動物：采用SPF級7日齡ICR小鼠乳鼠，母鼠自然哺乳，在ABSL-2實驗室獨立飼養。CA10動物模型建立實驗通過IACUC審核，符合動物實驗要求。

3.病毒感染：根據預實驗確定的感染劑量，即107 TCID50 CA10病毒，將病毒經灌胃途徑感染小鼠，感染劑量為100μl。對照組灌胃同等量的PBS。

一、疾病概述

手足口病是由多種腸道病毒引發的病毒性傳染病，主要傳播途徑是糞口傳播，多發于嬰幼兒以及5歲以下兒童。手足口病一般為自限性的，輕癥表現為發熱和手、足、口腔等部位出現皰疹或斑丘疹，多數患兒一周左右自愈；但少數患兒可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等重癥的神經系統并發癥。個別重癥患兒病情發展快，可導致死亡。引發手足口病的腸道病毒有20多種（型），主要由腸道病毒（enterovirus）、柯薩奇病毒（coxsakievirus）和埃可病毒（echovirus）組成。自2008年在新加坡的暴發流行，柯薩奇病毒A10型（CoxsackievirusA10，CA10）成為手足口病主要致病血清型之一，由其感染引起的手足口病爆發事件在法國、芬蘭、印度等國家和地區不斷被報道。在我國，2013年以前主要流行的手足口病病原以EV71和CA16為主，CA6和CA10次之；而在2013年以后，CA10引起的手足口病比例逐漸上升，成為國內手足口病感染的優勢病原體之一。CA10共分為A～G的7個基因型，可根據各地流行株的序列信息進行核苷酸和氨基酸的同源性對比，從而分析CA10的流行情況。在我國，CA10近年來在多地區流行的病毒株保持著較高的同源性，與其他國家的分離株之間的同源性距離較遠，具有地域分布特點以及一定的時間分布特點。CA10傳染性強、隱性感染比例大、傳播途徑復雜、傳播速度快，在短時間內可造成較大范圍的流行，疫情控制難度大。

CVA10屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，病毒直徑約30nm，衣殼包裹著單股正鏈RNA，無囊膜，呈正二十面體結構。CA10病毒主要通過糞口途徑傳播，經胃腸道進入機體內。病毒在入侵的局部上皮細胞中完成增殖，然后病毒侵入局部淋巴組織中繼續增殖并釋放入血導致第一次病毒血癥。病毒隨血液傳播接觸到正常靶細胞。病毒表面的VP1蛋白與靶細胞表面特異性受體結合，完成吸附過程，其基因組RNA進入胞質。之后，病毒以其正鏈RNA作為模板，合成互補的負鏈RNA，又以負鏈RNA為模板合成病毒正鏈RNA，從而得到大量病毒RNA，進入子代病毒顆粒組裝階段。通過轉錄、翻譯，復制出二代病毒，再次釋放入血形成第二次病毒血癥并引起臨床癥狀。目前有大量研究表明，手足口病患兒的細胞免疫出現紊亂，并且這種免疫紊亂在重癥與死亡病例中表現得更加嚴重。肺水腫被認為是感染的患兒中是最為嚴重的并發癥之一，腦干的損傷則被認為是導致肺水腫的重要因素。很多研究表明參與細胞免疫的諸多炎性因子，例如IL-1、IL-6、IL-10、IL-13、IFN-γ、TNF-α的增加、T細胞亞群CD3+CD4+，以及自然殺傷細胞（NK）等，與肺水腫的發生具有相關性。

CA10易感染5歲以下年齡的幼兒，潛伏期多為2-10天。CA10感染兒童多引起輕型手足口病、皰疹性咽峽炎等，患兒往往無明顯的早期癥狀，大多數病人預后良好。臨床上，往往表現為多發的斑丘疹和（或）皰疹，最多見于手足口、臂及膝關節。典型皰疹通常突出皮膚表面，呈現黃豆粒大小，圓形或橢圓形，其內液體混濁，常無疼痛和瘙癢感，約1周時間皰疹可自行消退，通常不留疤痕。病人或伴有發熱、流涕、咳嗽、食欲不振、惡心、嘔吐或腹瀉等癥狀，一般能自愈，無后遺癥。但少數兒童感染CA10后出現嚴重并發癥，如腦膜炎、腦炎、急性弛緩性麻痹和神經呼吸綜合征等。

由于CA10病毒主要通過糞口傳播，在自然感染狀態下是經胃腸道侵入機體的，因此通過灌胃感染途徑得到的動物模型更接近于疾病自然發生的狀態。課題組在原有CA10小鼠腹腔注射感染模型的基礎上，繼續研究了通過灌胃方式建立的小鼠感染模型，為研究病毒的感染機制和機體免疫反應提供研究基礎，也可用于藥物和疫苗開發和驗證實驗。

二、模型背景

1、CA10病毒信息

CA10病毒屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，是柯薩奇病毒A組成員，病毒呈對稱二十面球體結構，無囊膜，由蛋白外殼和核酸組成，其核酸為單股正鏈RNA。CA10病毒基因組為單股正鏈RNA，全長約7.4 kb。CA10基因組兩端為保守的非編碼區，中間為一個獨立連續的開放閱讀框架（ORF）。基因組的順序依次為5'端非編碼區，P1區、P2區、P3區和一段3'端非編碼區。5’端共價結合小分子蛋白質Vpg（約7kDa），與病毒RNA合成和基因組裝配有關；3’端帶有polyA尾。P1 區編碼4 種衣殼蛋白VP1 ~VP4，VP1 ~ VP3 在病毒表面，VP4 包裹在感染病毒的內部，這4種衣殼蛋白均具有抗原活性；P2 和P3 區編碼7 種非結構蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C 和3D，與病毒RNA 的復制、轉錄，病毒多聚蛋白的剪切、病毒顆粒的裝配等功能相關。CA10病毒可在RD細胞中培養，培養溫度為 37℃，48~96h達到復制高峰；病毒在宿主細胞漿內增殖，迅速引起細胞病變，表現為細胞皺縮、變圓脫落，最后病毒顆粒破膜釋放。CA10病毒的感染可以誘導機體產生高滴度的抗體，具有中和作用，能夠抵抗病毒的再次感染。2013年以后，CA10引起的手足口病比例逐漸上升，成為國內手足口病感染的優勢病原體之一。

2、實驗動物背景信息

ICR小鼠毛色白化。適應性強，體格健壯，繁殖力強，生長速度快，實驗重復性較好，雌鼠自發性畸胎瘤和管狀腺瘤發病率為0%~1%，用氨基甲酸乙酯誘發時，11~16天胚胎期畸胎瘤和管狀腺瘤發病率為5.9%，離乳個體管狀腺瘤和囊瘤發生率為30%，孕鼠為3%。是國際通用的封閉群小鼠。外周血項和骨髓細胞，具有較好的穩定性，是良好的血液學實驗用動物。10日齡以內的ICR乳鼠對手足口病原較為敏感，由于CA10病毒具有嗜肌性，乳鼠感染后常表現出豎毛、單肢癱瘓、雙肢癱瘓、甚至死亡的病癥，是進行是手足口病原研究的理想動物。

3、研究背景

隨著CA10流行程度的增加、重癥病例的出現，開發針對性的抗病毒藥物和疫苗成為當務之急；肌肉注射感染和腹腔注射途徑的感染與CA10病毒糞口傳播的自然感染方式存在一定的差距，因此有必要建立穩定的CA10病毒灌胃感染動物模型，不僅可以用于研究病毒自然感染機制和機體免疫反應，也補充了藥物和疫苗研發和驗證的關鍵模型。

目前國內的CA10病毒動物感染模型有泰山醫學院的史衛峰教授課題組的ICR乳鼠感染模型，采用5日齡ICR乳鼠感染CA10細胞適應株TA151R，感染劑量為1.5X103TCID50，感染途徑為肌肉注射（Protective Efficacies ofFormaldehyde-Inactivated Whole-Virus Vaccine and Antivirals in a Murine Modelof Coxsackievirus A10 Infection. Journal of Viology, 2017, Volume 91, Issue 13:e00333-17.）。

本課題組已建立的CA10病毒動物感染模型采用腹腔注射途徑，對7日齡ICR乳鼠感染104 TCID50 CA10病毒。感染4天后，感染小鼠的臨床癥狀由輕到重包括：駝背或炸毛，后肢無力，單后肢癱瘓，雙后肢癱瘓，嚴重的直至死亡。感染后第5天，感染小鼠臨床癥狀評分超過4分；感染后第7天，感染小鼠全部死亡。同時，相對于正常組小鼠，感染小鼠體重增加減緩。檢測感染小鼠血液和后肢肌肉中病毒載量發現：第3天血液中病毒載量到達高水平1.7X107 copies/μl，隨后下降至1.1X105copies/μl；后肢肌肉的病毒載量在第3天和第5天都維持很高的水平，分別為2.9X107 copies/mg和6.1X107 copies/mg。