白消安誘導小鼠骨髓抑制模型

造血干細胞損傷是長期骨髓抑制的主要誘因，前期的研究顯示造血干細胞衰老是造血干細胞損傷的一個重要的機制，針對于造血干細胞衰老的研究也有許多突破性的進展。前期的研究顯示，4Gy或6Gy全身照射，可以誘導造血干細胞衰老 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA ，電離輻射也可以通過激活p53-p21(Cip1/Waf1)通路誘導造血干細胞衰老，并且可以誘導造血干細胞的凋亡。而白消安則主要是通過誘導氧化自由基升高從而引起造血干細胞早老性改變（premature），并且不引起p53-p21(Cip1/Waf1)通路的表達變化。因而，白消安誘導的造血干細胞損傷模型與電離輻射誘導的造血干細胞損傷模型機制上有所差異，互為補充。

制備動物模型的過程中，使用白消安時操作者應該注意帶口罩和手套。

1、白消安降低小鼠外周血計數 為探究白消安對小鼠骨髓抑制的影響，我們選取6-8周周齡的C57小鼠15只，體重為18-20g，隨機分為三組，每組5只，分別為對照組，高劑量白消安組（40mg/kg）和低劑量白消安組（20mg/kg），給藥后15天，檢測小鼠的外周血計數。實驗結果顯示，給予白消安的小鼠外周血中WBC，PLT的數目與對照組小鼠相比顯著降低，40mg/kg白消安給藥組比20mg/kg白消安給藥組降低更嚴重。外周血中的紅細胞和血紅蛋白數目各組間無顯著性差異。實驗結果表明，高劑量白消安和低劑量白消安均引起C57小鼠外周血中白細胞和血小板數目降低，損傷造血系統(tǒng)功能。高劑量組損傷程度更嚴重。

圖1. 白消安對C57小鼠外周血計數的影響。C57小鼠接受低劑量和高劑量白消安給藥，15天后用血細胞計數儀檢測外周血中白細胞計數（A），紅細胞計數（B），和血紅蛋白計數（C），以及血小板計數（D）。結果means ± SE 表示，n=5。

2. 白消安對小鼠骨髓計數和體重的影響 觀察給藥對小鼠體重的影響，結果顯示，與對照組相比，白消安給藥組小鼠的體重未發(fā)現明顯差異。小鼠體態(tài)正常，未發(fā)現弓背和萎靡的癥狀。小鼠骨髓細胞計數結果顯示，給藥后15天，給藥組小鼠的骨髓有核細胞計數與對照組相比，未見明顯變化。提示白消安對骨髓有核細胞數目無明顯影響，或者給藥15天后骨髓有核細胞有所恢復。

圖2. 白消安對C57小鼠外周血和骨髓細胞計數的影響。C57小鼠接受低劑量和高劑量白消安給藥，給藥后不同時間段檢測各組間小鼠體重變化（A），給藥15天后檢測小鼠骨髓有核細胞數（B）。結果means ± SE 表示，n=5, *p < 0.05。

3、白消安降低C57小鼠造血干細胞比例 為探究白消安對C57小鼠造血系統(tǒng)損傷作用，小鼠給藥后15天，用流式細胞儀檢測小鼠的骨髓細胞，流式門如圖3所示。我們檢測了造血祖細胞（lineage-scal-1-ckit+ ，HPC），造血干細胞細胞（lineage-scal-1+ckit+，HSC），長期造血干細胞（lineage-scal-1+ckit+CD34+，LT-HSC）的比例和數目。實驗結果如圖3.所示，給予低劑量白消安小鼠HPC，HSC，LT-HSC的比例與對照組小鼠相比分別下降20.84%（1.084±0.182 vs 0.858±0.122），47.05%（0.340±0.054% vs 0.180%±0.044%）和49.80%（0.038±0.009vs 0.019±0.008）；給予高劑量白消安小鼠HPC，LSK，HSC的數目與對照小鼠相比分別下降51.84%（1.084±0.181 vs 0.522±0.132），70.59%（0.340±0.054 vs 0.100±0.001）和69.38%（0.038±0.009 vs 0.011±0.002）（P<0.05）；以上的實驗結果說明，表明白消安引起造血干細胞，造血祖細胞比例和數目顯著降低，高劑量組與低劑量組相比損傷程度更加明顯。

圖3. 白消安對造血干細胞比例的的影響。C57小鼠白消安給藥后15天，無菌取骨髓細胞流式細胞儀檢測造血細胞分型。A.流式細胞儀分析時門的設置。B.造血祖細胞（lineage-scal1-ckit+，HPC）比例。C.造血干細胞（lineage-scal1+ckit+，LSK），細胞的比例。D.長期造血干細胞（CD34-lineage-scal1+ckit+，HSC）的比例。結果用means± SE 表示，n=5。

4、白消安損傷小鼠造血細胞功能 為了檢測白消安對C57小鼠造血系統(tǒng)功能的影響，分組和給藥方式如上述，白消安給藥后15天，檢測粒細胞巨噬細胞集落形成能力。粒細胞巨噬細胞集落形成能力實驗（colonyforming unit –granulocyte and macrophage， CFU-GM），主要檢測造血祖細胞分化為特定細胞群的能力。CFU-GM實驗結果顯示，小鼠接受低劑量白消安給藥后，骨髓細胞的CFU-GM集落形成數與對照組相比沒有統(tǒng)計學差異（113.3±28.05 vs 142.5±18.64，p>0.05），前期的研究結果顯示，小鼠骨髓損傷后15天是小鼠損傷恢復期，雖然HSC和HPC的比例和數目依然顯著低于對照組（如圖4所示），但是CFU-GM的實驗顯示，造血祖細胞增殖抑制已經有所緩解。小鼠接受高劑量白消安給藥后，骨髓細胞的CFU-GM集落形成數較對照組下降65.42%（113.3±28.05 vs 39.17±8.89，p<0.05）。差異均具有統(tǒng)計學意義。說明40mg/kg白消安可以顯著誘導造血祖細增殖抑制。

圖4. 白消安誘導C57小鼠造血干細胞和造血祖細胞增殖抑制。C57小鼠接受高劑量和低劑量白消安給藥，15天后無菌取骨髓細胞，接種到甲基纖維素培養(yǎng)基（M3534，stemcell），接種后第七天檢測CFU-GM。集落形成數≥50 個細胞群落為陽性克隆，統(tǒng)計105 BMCS中集落形成數目。流式細胞儀分選LT-HSC細胞到培養(yǎng)基中，第14天檢測單細胞集落形成數目，結果用陽性孔在接種孔中比例顯示。A.CFU-GM的數目。B.單細胞集落陽性率。結果用means ± SE 表示，n=5。

單細胞集落形成能力，利用造血干細胞接種在特定的培養(yǎng)基里，15天后集落形成能力評價造血干細胞的功能。實驗結果顯示，給與低劑量組白消安的小鼠單細胞集落形成能力與對照組相比降低33.81%（0.62±0.13 vs 0.41±0.23，p>0.05）；而給與高劑量組白消安的小鼠單細胞集落形成能力與對照組相比降低58.06%（0.62±0.13 vs 0.26±0.15，p<0.05），表明40mg/kg白消安可以明顯降低造血干細胞功能。

為了進一步確定白消安誘導造血干細胞損傷模型，我們進一步檢測了給藥15天和給藥30天后造血祖細胞和造血干細胞的功能。實驗結果顯示，小鼠給予40mg/kg白消安，30天后外周血象和HSC和HPC的比例都有所恢復（結果未列出），CFU-GM的降低百分比與15天相比有所恢復（60.71% vs 54.26%），然而單細胞集落形成能力進一步降低（45.16% vs73.80%）。說明隨著時間的延長，白消安對骨髓造血干細胞的損傷進一步加劇。

圖5. 給藥后不同時間檢測白消安對C57小鼠造血干細胞和祖細胞集落形成能力的影響。

C57小鼠接受高劑量(40mg/kg)白消安給藥，15天和30天后分別無菌取小鼠骨髓細胞，接種到甲基纖維素培養(yǎng)基（M3534，stemcell）和干細胞增殖培養(yǎng)基中，接種后第7天檢測CFU-GM，第14天檢測造血干細胞單細胞集落形成能力。CFU-GM結果為105 BMCS中集落形成數目。單細胞集落形成能力以陽性細胞占接種細胞比例表示。A.CFU-GM的數目。B.單細胞集落陽性率。結果用means ± SE 表示，n=5。

模型評價方法：1）高劑量組（40mg/kg）和低劑量組（20mg/kg）白消安誘導C57小鼠造血祖細胞及造血干細胞損傷；2）小鼠外周血和骨髓細胞計數，造血干細胞，造血祖細胞和長期造血干細胞比例降低；3）小鼠造血祖細胞增殖能力（CFU-GM）下降；4）造血干細胞功能（單細胞集落）下降；造血干細胞分化和自我更新能力（骨髓移植測定）下降。

1.實驗小鼠 SPF級雄性C57小鼠35只，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供［SCXK（京）2014-0004］。飼養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所屏障環(huán)境動物房［SYXK（京）2015-0035］，實驗方案通過醫(yī)學實驗動物研究所實驗動物管理和使用委員會（IACUC）審批，IACUC號為：MAM16003。動物實驗經過福利倫理審查，符合3R原則。

2. 小鼠分組和給藥 白消安（busulfan）購自于sigma。白消安粉末由DMSO配置為80mg/ml作為母液貯存，使用時用PBS稀釋為所需濃度。小鼠分為對照組，低劑量給藥組（20mg/kg）和高劑量給藥組(40mg/kg)，每組5只。腹腔注射，高劑量給藥組分兩天給藥，每天給予20mg/kg。對照組小鼠給予等體積含5%DMSO的PBS作為對照。

3. 造血干細胞和造血祖細胞比例測定 分離的骨髓細胞，調整細胞濃度到1′ 107/ml，每只小鼠取100ul細胞用于后續(xù)染色。按體積比1:50加入biotin標記的混合一抗抗體CD4，CD8， B220，Ter119，Gr1，CD11b，均購自BD bioscience，4℃條件下孵育30min，PBS洗滌一次，離心條件為1400r/min，5min。離心后棄去上清，保持100ul體積，加入混合抗體Streptavidin（percp標記），scal-1（PE標記），ckit（APC標記），CD34（FITC標記），以上抗體均購自BD bioscience。4℃條件下孵育1h。之后PBS洗滌兩次，離心條件如上。BD流式細胞儀（FACSAriaTMII，BD）檢測造血祖細胞（Lin-c-kit+ Sca1-or LKS- cells），造血干細胞（Lin- c-kit+ Sca1+or LKS+ cells），長期造血干細胞（CD34-Lin-c-kit+Sca1+）在骨髓中所占的比例。

4.骨髓細胞計數 小鼠分組和給藥方式如上述，白消安給藥后15天小鼠CO2安樂死，75%酒精浸泡消毒，之后在無菌的條件下取小鼠單側股骨，用含2％FBS的PBS緩沖液沖洗骨髓，將單側股骨沖洗至2mLEP管中，保持體積為1ml，每只小鼠取10ul用于骨髓細胞計數。

5.粒細胞集落形成能力測定（colonyforming unit-granulocyte and marchrophage， CFU-GM） CFU-GM實驗通過檢測粒細胞巨噬系細胞的集落形成能力，用來檢測造血祖細胞分化為粒細胞巨噬細胞的能力。無菌取小鼠骨髓細胞，用PBS將小鼠骨髓濃度調整至4×105/ml，每個樣加0.2ml細胞至事先分裝好的2ml M3534培養(yǎng)基中，振蕩器充分混勻，靜置2～5min，待氣泡消失。加入24 孔板，每孔0.5ml。輕搖培養(yǎng)板，使培養(yǎng)基均勻分布。將培養(yǎng)板放入濕盒，置入37oC，5％CO2 培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)第7天在倒置顯微鏡下觀察。低倍觀察集落形成情況，細胞數≥50 為陽性集落。

6.外周血計數 用抗凝管收集外周血。自動血細胞計數儀（ABX pentra DX 120，法國）測定外周血中白細胞數（WBC）、紅細胞數（RBC）、血紅蛋白含量（HGB）和血小板（PLT）等指標。

7.單細胞集落能力檢測 本方法依據前期發(fā)表文章 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA [8, 9]，分離的骨髓細胞，調整細胞濃度到1′ 107/ml，每只小鼠取100ul細胞用于后續(xù)染色。按體積比1:50加入biotin標記的混合一抗抗體CD4, CD8, B220，Ter119，Gr1，cd11b，4℃條件下孵育30min，PBS洗滌一次，離心條件為1400r/min，4℃，5min。離心后棄去上清，保持100ul體積，加入混合抗體Streptavidin（percp標記），scal-1（PE標記），ckit（APC標記），CD34（FITC標記）。4℃條件下孵育1h。之后PBS洗滌兩次，離心條件如上。BD流式細胞儀（FACS AriaTMII，BD）分選長期造血干細胞（CD34-Lin-c-kit+Sca1+）到提前加了100ul甲基纖維素培養(yǎng)基（Gibco MAM HS001）的96孔板中。每個孔兩個細胞，待接種分選造血干細胞，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)15天，低倍觀察集落形成情況，細胞數≥50 為陽性集落，結果計算每組陽性孔比例。

8. 統(tǒng)計學分析 采用GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計分析。計量數據以均數±標準差誤（mean±SEM）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（one-way AVOVA）和Tukey 多重比較法（Tukey's Multiple Comparison Test），重復測量數據采用重復測量數據方差分析方法。P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。

一、疾病概述

骨髓抑制是指骨髓中的幼稚造血細胞活性下降。外周血的紅細胞和白細胞都源于骨髓中的造血干細胞。外周血血細胞壽命短，常常需要不斷補充。為了達到及時補充的目的，需要造血干細胞、造血祖細胞必須快速分裂。化學治療（chemotherapy）和放射治療（radiotherapy）以及許多其它抗腫瘤治療方法，都是針對快速分裂的細胞，因而常常導致正常骨髓抑制。

1.病因 骨髓抑制是多數化療藥的常見毒性反應，是化療終止的常見限制性因素。血細胞由多種成分組成,每一種成分都對人體起著不可缺少的作用,任何一種成分的減少都使機體產生相應的副反應。

白消安（Busulfan），商品名馬利蘭，1,4-丁二醇二甲烷磺酸鹽，屬甲烷磺酸酯類烷化劑抗惡性腫瘤藥，在體內解離后起烷化作用，主要通過與DNA形成交叉聯(lián)結而破壞DNA結構。白消安口服易吸收，可口服給藥，組織分布迅速，t1/2約為2-3h；絕大部分與谷胱甘肽結合，通過肝內的谷胱甘肽轉移酶催化并代謝呈甲烷磺酸由尿排出 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA 。

小劑量白消安即可明顯抑制粒細胞生成，對慢性粒細胞性白血病（Chronic Myelocytic Leukemia, CML）療效顯著，對慢性粒細胞白血病急性病變無效，由于不良反應即骨髓抑制較嚴重，逐漸被伊馬替尼（Imatinib）替代，目前僅用于骨髓移植。白消安能夠誘導腫瘤細胞凋亡，主要副作用是造血干細胞功能受損，當劑量較高時也會損傷造血祖細胞功能。白消安還可能通過誘導HSC衰老損傷骨髓造血系統(tǒng)功能。與白消安藥物作用機制相似的有：烷化劑-氮芥、環(huán)磷酰胺；鉑類配合物-順鉑；抗腫瘤抗生素-絲裂霉素等等。白消安常用來構建再生障礙性貧血動物模型和男性無精子癥動物模型。

2.臨床表現 骨髓抑制是腫瘤化療藥物的主要劑量限制性毒性之一，除激素類、博來霉素和L-門冬酰胺酶外，大多數抗腫瘤藥物均會導致不同程度的骨髓抑制。經化療后通常先出現白細胞減少，然后出現血小板降低，嚴重情況下會出現貧血。

3. 骨髓抑制的級別診斷 骨髓的抑制程度根據WHO分為0～Ⅳ級：

表1. 骨髓的抑制程度分級

骨髓抑制通常發(fā)生在化療后。因粒細胞平均生存時間最短，約為6-8小時，因此骨髓抑制常最先表現為白細胞下降;血小板平均生存時間約為5-7天，其下降出現較晚較輕;而紅細胞平均生存時間為120天，受化療影響較小，下降通常不明顯。多數化療藥物所致的骨髓抑制，通常見于化療后1-3周，約持續(xù)2-4周逐漸恢復，并以白細胞下降為主，可有伴血小板下降，少數藥如健擇、卡鉑、絲裂霉素等則以血小板下降為主。所以在化療后可檢測白細胞和血小板的數量來判斷是否發(fā)生了骨髓抑制。

3.臨床治療 化療后出現骨髓抑制常用各種集落刺激因子如粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（Granulocyte-Macrophage ColonyStimulating Factor, GM-CSF）、粒細胞集落刺激因子（GranulocyteColony Stimulating Factor, G-CSF）、巨噬細胞集落刺激因子（MacrophageColony Stimulating Factor, M-CSF）、促紅細胞生成素（Erythropoietin,EPO）等來處理血象降低，護理中必須采取措施預防各種感染和防治出血等。

二、模型背景

1、實驗動物背景信息

C57BL/6J小鼠。

2、研究背景

由于骨髓抑制是腫瘤化療藥物的主要劑量限制性毒性之一。歷來是臨床和基礎研究極為關注的內容。具有細胞毒性的化療藥物，低劑量主要損傷骨髓造血祖細胞（HPC），在臨床上癥狀比較明顯，目前主要應用一些生長因子進行恢復治療。當化療藥物劑量大或者一些敏感的患者會出現造血干細胞（HSC）損傷，逐漸出現全血減少，在臨床上起病比較隱匿，容易被忽視。一旦發(fā)生，缺乏有效的治療方法，預后較差。因此化療導致骨髓損傷防治的研究歷史也比較長。比較常用的是環(huán)磷酰胺（CTX），環(huán)磷酰胺主要對淋巴細胞殺傷作用比較強，在大劑量下才可以引起造血干祖細胞損傷。白消安則對造血干細胞的毒性較大。利用白消安制備的骨髓抑制模型對研究化療導致的造血干細胞損傷機制研究具有一定的優(yōu)勢。

小鼠尤其C57小鼠在研究造血系統(tǒng)的生理及病理調節(jié)方面應用最為廣泛。另外大動物包括犬、猴等都有造模用于造血系統(tǒng)化療藥損傷的預防與治療。