輻射誘導小鼠肺損傷模型

制備動物模型使用的小動物照射設備自身帶有防護設施，使用安全。

1．小鼠右肺局部照射后不同時間小鼠皮毛損傷性改變

小鼠右側肺部受到17 Gy照射，表皮會受到不同程度的損傷，白化損傷區域和照射區域重合，表明照射定位準確（圖1）。如果出現局部破損及炎癥時給予抗生素軟膏涂抹。

2. 小鼠右肺局部照射對肺組織結構的影響

小鼠受照側肺組織HE染色后進行鏡下觀察。病理學鏡檢人員單盲對組織切片進行評分。結果顯示小鼠右肺受照后8周開始病理評分增高，表明小鼠右肺局部照射發生明顯病變，并且呈進行性加重(見圖2)。

圖2小鼠右肺局部照射對肺組織結構的影響。圖A為鏡檢HE染色，100倍；圖B為肺組織病理學評分。肺組織病理學評分用mean±SE表示，n=6，a：與Control組相比p<0.01。

3. 小鼠右肺局部照射對肺組織膠原生成的影響。

觀察小鼠右肺局部照射后不同時間點對肺組織膠原生成的影響，結果顯示Control組小鼠肺組織幾乎看不見陽性著色。受照組小鼠肺組織膠原沉積陽性著色面積比增高，纖維化程度增高。表明小鼠右肺局部照射后肺組織中膠原沉積面積增大，并且呈進行性加重（圖3A、B）。肺組織羥脯氨酸測定呈現相同趨勢（圖3C）。肺組織纖維蛋白相關基因表達水平受照后逐漸升高（圖3D、E）。上述結果提示小鼠右肺局部照射導致肺纖維化的模型成立。

圖3 受照后肺組織增生性改變（A，B）受照肺組織Masson染色及評分； C 受照肺組織羥脯氨酸含量測定；（D，E）肺組織細胞內纖維沉積相關因子mRNA的表達水平。

a，與control (CTL)相比 P<0.05；b, 與受照后(IR)8周組相比 P<0.05; c, 與受照后16周相比P<0.05

模型成立的指標包括：1）小鼠接受大劑量（17Gy）胸部局部照射；2）受照后16周后受照肺組織進行鏡下病理觀察，HE染色呈現纖維增生狀態，病理評分明顯升高；Masson染色綠色膠原沉積增多；肺組織勻漿檢測羥脯氨酸含量升高。3）進行評價時也可以觀察受照后小鼠30周存活率（非特異性指標）；4）有條件時可以進行小鼠MicroCT胸部成像進行近期和遠期觀察。

1. 實驗材料 C57BL/6雄性小鼠（SPF級）由中國醫學科學院醫學實驗動物研究所提供，合格證號[SCXK(京)2015-0035]，體重20.0-22.0 g，周齡8-12。

2. 照射條件 X線生物輻照儀（RS2000，美國Rad Source Technologies）照射，照射劑量為17 Gy，劑量率為3.12 Gy/min。照射面積為1.5 cm2，源皮距為15 cm。

3. 組織處理、切片 C57小鼠肺組織取材固定于4% 的中性甲醛24 h，修塊至肺組織最大橫截面，脫水后制作石蠟塊。用石蠟組織切片機制作4 μm的切片，切片常規HE染色、Masson染色、免疫組織化學，封片后用正置顯微鏡（BX51，Olympus，Japan）觀察。

4.HE染色 組織切片在病理平臺進行蘇木素-伊紅常規染色。HE染色后進行鏡下觀察。病理學鏡檢人員對小鼠受照側肺組織組織切片進行單盲評分。來自于動物的右肺的全部被檢玻片均隨機化檢測。這一評分系統由一個0~12分范圍的可數評分組成，每張切片，由肺泡間隔增寬、肺泡腔內纖維化滲出的嚴重度、血管周圍炎細胞浸潤的程度進行分類評分，每種分類根據病變程度又分為：0分為正常；1分為輕度；2分中度；3分重度；4分極重度。合并后記分。

5.Masson染色 肺組織切片在病理平臺常規處理，進行Masson復合液染色，結果細胞核染黑藍色，膠原纖維呈綠色，神經膠質纖維、肌纖維、紅細胞呈紅色。圖像用單反數碼相機（D90，Nikon，Japan）進行采集，肺組織橫截面積用Image-Pro Plus5.1（IPP，Media Cybernetics，Inc. USA）軟件進行計算，結果用膠原沉積面積占組織總面積的比值表示。

6.肺羥脯氨酸含量測定 冷凍肺組織制備勻漿。使用羥脯氨酸比色分析試劑盒（BioVision，Milpitas，CA）測量勻漿中的膠原蛋白含量。數據以每毫克肺勻漿蛋白質的微克羥脯氨酸表示。

7.小鼠纖維化相關基因PCR檢測 于照射后8周、16周、23周取小鼠右肺中葉，每組3只，迅速保存于-80℃冰箱，樣本處理后按照試劑盒提供的實驗步驟進行基因表達測定分析。

一、疾病概述

放射性肺損傷（Radiation-inducedPulmonaryInjury）又稱放射性肺炎（radiation pneumonia），是由于對胸部的惡性腫瘤進行放射治療引起的并發癥，最多見于對肺癌、乳腺癌，其次是對食管癌、縱隔惡性腫瘤的放療。放射治療后在放射野內的正常肺組織受到損傷而引起的炎癥反應。輕者無癥狀，炎癥可自行消散；重者肺臟發生廣泛纖維化，導致呼吸功能損害，甚至呼吸衰竭。

1 病因 肺經照射后，電離輻射產生的自由基損傷肺泡上皮和毛細血管內皮細胞的細胞膜和DNA，導致細胞功能不良和死亡是照射后致肺組織損傷的直接原因；同時，照射引起照射野局部細胞因子含量增多，成纖維細胞生長因子和趨化因子共同作用于照射區，使肺組織產生損傷，最終導致肺纖維化和肺硬化。

2.病理改變 急性期的病理改變多發生于放射治療后1～2月，表現為肺血管，特別是毛細血管損傷產生充血、水腫和細胞浸潤，肺泡Ⅱ型細胞再生低下，淋巴管擴張和透明膜形成。急性變化有可能自行消散，但常引起肺結締組織增生，纖維化和玻璃樣變。慢性期往往發生于放射治療9個月以后，病理為廣泛肺泡纖維化，肺臟收縮，毛細血管內膜增厚、硬化，管腔狹窄或阻塞而導致肺循環阻力增高和肺動脈高壓。胸膜也可因炎變和纖維化而增厚。細支氣管粘膜上皮間變，肺繼發性感染，可促進放射性纖維化。

3.臨床表現 輕者無癥狀，多于放射治療后2～3周出現癥狀，常有刺激性、干性咳嗽，伴氣急、心悸和胸痛，不發熱或低熱，偶有高熱。氣急隨肺纖維化加重呈進行性加劇，容易產生呼吸道感染而加重呼吸道癥狀。并發放射性食管炎時出現吞咽困難。若放射損傷肋骨，產生肋骨骨折，局部有明顯壓痛。體檢見放射部位皮膚萎縮、變硬，肺部可聞及干、濕羅音和磨擦音。肺部廣泛、嚴重纖維化，最后導致肺功能高壓及肺源性心臟病，出現相應征象。

4.檢查手段

1）X線胸片：急性放射性肺炎發生于放療近結束時至放療后2個月內，肺放射野內呈片狀均勻密度模糊影，多發邊界不清的小斑片狀陰影，病灶邊緣與放射野一致，與正常肺組織有明顯分界，此為本病特征表現。

2）肺功能改變：肺放射性肺炎和纖維化都引起限制性通氣功能障礙，肺順應性減低，伴通氣/血流比例降低和彌散功能減低，導致缺氧。有時胸片尚未發現異常，而肺功能檢查已顯示變化。

5.診斷與鑒別診斷 根據放射治療史，干性嗆咳，進行性氣急和胸部X線有炎癥或纖維化改變可作出診斷，但應與肺部腫瘤惡化和轉移性腫瘤相鑒別，支氣管粘膜上皮經照射后常引起細胞間變，應與癌腫細胞相區別。

6.治療原則 主要是對癥治療，對僅有影像學表現而無臨床癥狀者，不予特殊治療；若有咳嗽、咳痰，對癥治療；肺部繼發感染給予抗生素，早期應用糖皮質激素有效，抗凝療法治療小血管栓塞無效，給予氧氣吸入能改善低氧血癥。有清熱解毒、養陰益氣和活血化瘀功效的中藥具有不同程度的預防和治療放射性肺炎的作用，與西藥合用，能明顯緩解癥狀，改善放療后肺纖維化的病理改變，加速肺功能的恢復。

7.預防 為預防放射性肺炎的發生，應科學合理制定放療方案，盡可能縮小照射面積，減少對正常肺組織的照射劑量。在放射治療過程中，應嚴密觀察患者有無呼吸道癥狀及體溫升高。X線檢查發現肺炎，應立即停止放射治療。

參考文獻

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二、模型背景

1、實驗動物背景信息

C57BL/6J小鼠。

2、研究背景

放射性肺損傷是胸部放射治療的重要限制因素。尤其是放射性肺纖維化可以導致患者呼吸困難甚至嚴重的呼吸功能不全，使放療患者生活質量嚴重下降。根據判斷終點及影響因素的不同，放射性肺纖維化發病率報道的波動范圍很大，可以從1%至43%。目前放射性肺纖維化發病機制尚未闡明，臨床上也缺乏明確的早期診斷和有效治療方法，發病患者預后很差，因此對放射性肺纖維化機制的研究及防治藥物的研發一直是臨床亟需解決的問題，也是當前的研究熱點。

建立放射性肺損傷動物模型對于發病機制研究、研發適用于臨床的預測性生物標志物和有效的治療藥物具有重要的意義。研究使用最多的是在嚙齒類動物模型，目前認為C57BL/6小鼠對放射性肺纖維化比較敏感。由于輻照設備的改善，可以進行小動物雙肺或單肺的局部照射制備模型。因為實驗室條件及實驗動物采用的照射劑量、放射性肺損傷出現的性質及程度略有差異；模型評價指標多以受照動物生存期和肺部病理改變為主。這與臨床上放射性肺炎及纖維化形成多伴有胸膜癥狀不一致；臨床檢測包括有胸部影像學檢查、肺功能檢查在小鼠模型上難以操作。這可能是影響防治措施研究的臨床轉化的原因之一。

參考文獻：

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