鐵過載小鼠的活動性結核病模型

腹腔注射中等劑量（7.5 mg/次，3 次/周，共 4 周）右旋糖酐鐵溶液可成功構建外源性鐵過載小鼠模型，通過尾靜脈注射 Mtb 可構建活動性結核病鐵過載小鼠模型。模型評價的主要指標是鐵過載小鼠外周血血清鐵和鐵蛋白水平，以及各臟器組織 HE與普魯士藍染色來確證。鐵過載的結核動物模型主要通過組織荷菌量和病變來綜合評價。

本模型中鐵過載模型參考文獻報道的方法，而鐵過載的小鼠結核模型采用本研究室結核模型制備方法，目前未見報道。

該模型模擬臨床上先天性代謝障礙導致體內鐵過度蓄積；同時，持續性大量輸血、長期內服鐵劑或某些血液性疾病均可導致機體鐵負荷過載患者，可用于研究鐵過載對機體抗結核免疫應答損傷機制，以及鐵過載如何促進巨噬細胞內 Mtb 的生長及其在 TB 的發生發展機制。

動物模型的制備的設計得到研究所IACUC委員會的批準，人員都是訓練有素的研究人員和實驗人員，全程在ABSL-3實驗室中進行，完全按照模型制備和檢測的一系列SOP操作進行，遵守生物安全操作要求，無安全事故。

1、 表型分析

1.1 鐵過載小鼠組織形態及體重評估

鐵過載小鼠外觀與正常小鼠無明顯區別，自主活動穩定，精神狀態平穩。解剖后正常小鼠各臟器組織表面光滑，無充血、水腫。鐵過載小鼠肝臟顏色呈暗褐色，且隨著右旋糖酐鐵劑量增加而逐漸加深，其他臟器組織無明顯顏色及形態 變化（圖 1）。低劑量組、中劑量組與陰性對照組相比體重增長無顯著差異。高劑量組體重增長略有減緩，且與其他劑量實驗組及陰性對照組比較差異有明顯統計學意義( 圖 2，P ＜ 0.05)。

圖 1. 不同劑量鐵過載小鼠肝臟變化

圖 2. 不同劑量鐵過載小鼠體重增長百分比

*表示高劑量組與低劑量組、中劑量組及陰性對照組比較，P ＜0.05。

2.2 鐵過載小鼠組織鐵含量變化

鐵過載小鼠中肝組織含鐵量最高，與陰性對照組小鼠相比增加接近 7 倍。其次，組織鐵含量由高至低依次為脾臟，腎臟及小腸。高劑量組和中劑量組各臟器組織鐵含量均顯著高于陰性對照組（圖 3，P 均 ＜ 0.05），低劑量組小鼠心臟和肺組織鐵含量顯著低于其他劑量組，與陰性對照組相比無顯著性差異（圖 3， P ＞ 0.05）。

圖 3. 不同劑量鐵過載小鼠組織含鐵量

*表示各不同劑量組與陰性對照組比較，P ＜0.05；**表示各不同劑量組與陰性對照組比較，P ＜0.01。

2.3 鐵過載血生化指標變化

鐵過載小鼠分別于鐵劑注射 4 周后取外周血血清進行血清鐵、鐵蛋白、轉鐵蛋白和可溶性轉鐵蛋白受體檢測，結果如圖 4 所示。陰性對照組和各不同劑量鐵劑組小鼠血清鐵水平分別為19.95 ± 5.64 μmol/L、43.00 ± 6.82 μmol/L、65.84 ± 167 9.31 μmol/L 和 108.45 ± 9.90 μmol/L，組間差異有明顯統計學意義 (圖 4，P 均 ＜ 0.05) 。進一步檢測各組動物外周血鐵蛋白水平分別為 773.82 ± 161.51 μg/L、 169 1063.68 ± 65.15 μg/L、1344.08 ± 168.57 μg/L 和 1694.73 ± 44.45 μg/L，組間差異同樣有明顯統計學意義( 圖 4，P 均 ＜ 0.05) 。然而，各劑量組小鼠轉鐵蛋白和可溶性轉鐵蛋白受體水平與正常對照組小鼠相比均無顯著差異（圖 4，P ＞ 0.05）。

圖 4. 不同劑量鐵過載小鼠血清鐵、鐵蛋白、轉鐵蛋白和可溶性轉鐵蛋白受體水平

(a)：血清鐵，(b)：血清鐵蛋白，(c)：血清轉鐵蛋白，(d)：血清可溶性轉鐵蛋白受體。*表示各不同劑量組與陰性 對照組比較，P ＜0.05；**表示各不同劑量組與陰性對照組比較，P ＜0.01。

3、病理表型

鐵過載小鼠組織HE 染色與鐵染色鐵過載模型中高劑量組小鼠肝臟、脾臟和腎臟組織HE 染色均可見大量團狀含鐵血黃素沉積。肝細胞核固縮、溶解，胞漿內滿布蛋白微粒；脾小體與紅髓區界限不清；小腸及心臟組織可見部分含鐵血黃素沉積，心肌纖維出現排列異常，炎性細胞浸潤，充血水腫、出血等病理變化；肺部可見小數鐵蛋白微粒，支氣管和血管周圍及其管腔內炎性細胞浸潤，嗜酸性粒細胞及淋巴細胞滲出，并可見肺泡不均勻擴張，肺泡間隔斷裂等。中劑量組和低劑量組僅肝臟和脾臟可見含鐵血 黃素沉，且含鐵血黃素沉程度與鐵劑量成正相關；心臟、肺、腎臟及小腸等組織未見明顯含鐵血黃素沉積及炎性細胞浸入，與陰性對照組相比無明顯變化（圖6）。普魯士藍染色與組織鐵含量測定結果一致，陰性對照組小鼠各組織鐵染色為陰性，高劑量組小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟和小腸等組織大量胞外鐵和胞內鐵呈顆粒狀、塊狀亮藍色鐵沉積。中劑量組肝臟和脾臟組織鐵沉積較明顯， 心臟、肺、腎臟和小腸僅可見小量鐵沉積，均未見組織形態改變。低劑量組小鼠中心臟和肺組織則未見明顯鐵沉積，與陰性對照組相比無顯著改變（圖 7）。

圖 6. 不同劑量鐵過載小鼠組織 HE 染色（× 20）

圖 7 不同劑量鐵過載小鼠各組織普魯士藍染色（× 20）

圖 7. 結核感染鐵過載小鼠肺脾肝組織病理變化（× 20）

4.鐵過載結核病小鼠組織荷菌量

對中劑量右旋糖酐鐵建立的鐵過載小鼠模型進行 Mtb 感染試驗，感染后 4 周解剖并進行肺、脾和肝臟病理分析和荷菌量檢測，結果表明鐵過載結核病小鼠構建成功。如圖 7 所示，肺脾及肝組織病理 HE 染色中鐵過載 Mtb 感染組肺組織出現多處炎癥反應，呈實變趨勢，其中肺泡壁增厚，肺泡腔被淋巴細胞等炎癥細胞填充。結核性肉芽腫顯著增加且多于空白 Mtb 感染組。脾臟白髓被結核肉芽腫病變破壞，可見炎癥細胞聚集，且病變較重。同樣，鐵過載 Mtb 感染小鼠肝臟可見水腫、淤血，光鏡下肝細胞內可見團塊狀鐵褐色沉積，Mtb 感染后出現多個散在小肉芽腫樣病變。同時，感染小鼠肺、脾臟和肝組織荷菌量比較發現，鐵過載 Mtb 感染組荷菌量比空白 Mtb 感染組各靶器官較高，且具有統計學差異（圖 8，P 均 ＜ 0.05）。

圖 8 結核感染鐵過載小鼠肺脾肝組織荷菌量分析

1.1實驗材料

C57BL/6N 小鼠（北京維通利華，SCXK (京)-2016-0006），右旋糖酐鐵注射液（江西創導動物保健品有限公司），血清鐵、鐵蛋白、轉鐵蛋白及可溶性轉鐵蛋白受體檢測試劑盒（酶免公司），組織鐵檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），普魯士藍染色試劑盒（Solarbio），結核分支桿菌標準株 H37Rv（菌號為 93009，本室保存），中性羅氏培養管（珠海貝索生物），BACTEC MGIT 7H9 98 分支桿菌快速培養管（BD 公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 鐵過載小鼠模型建立

6~8 周齡 SPF 級雌性 C57BL/6N 小鼠隨機分成陰性對照、低劑量、中劑量和高劑量 4 個小組，實驗組分別腹腔注射右旋糖酐鐵3.75、7.5、15 mg/次，陰性對照組小鼠腹腔注射等體積生理鹽水，3 次/周，共計 4 周。定期觀察小鼠生長及精神狀態，稱重并記錄。動物實驗經本所實驗動物管理和使用委員會（IACUC）批準，批準號為：ZLJ2019001。

1.2.2 血清生化指標與組織鐵含量測定

建模完成后將小鼠摘眼球采血，4 ℃凝結過夜，2000 g 4 ℃離心 10 min，分離小鼠血清并檢測血清鐵、鐵蛋白、轉鐵蛋白及可溶性轉鐵蛋白受體含量。解剖取小鼠心臟，肝臟、脾臟、肺、腎臟及小腸等組織器官，稱重后加 1ml 生理鹽水充分研磨并裂解組織碎片，12000 g4 ℃離心 20 min，取上清并測定蛋白濃度。血清生化檢測按試劑盒說明書進行，組織鐵測定則按試劑盒測定方法計算相同蛋白濃度下各組織鐵含量。

1.2.3 鐵過載小鼠 Mtb 感染

SPF 級 C57BL/6N 隨機分成空白對照組、空白 Mtb 感染組、中劑量鐵過載模型組和中劑量鐵過載模型 Mtb 感染組，每組 6 只。其中 Mtb 感染組小鼠經尾靜脈注射對數生長期 H37Rv 單細胞菌懸液 100 μl（1×10 6 CFU/ml），空白對照組注射等劑量無菌生理鹽水。本所 ABSL-3 實驗室（國衛 ABSL3-059）正常飼喂， 觀察并記錄小鼠臨床表現，感染后 4 周解剖小鼠。

1.2.4 小鼠組織荷菌量測定

ABSL-3 實驗室動物解刨臺中解剖感染小鼠，無菌取小鼠肺、脾和肝臟組織；拍照記錄肺、脾和肝臟等器官大體病變情況，取小鼠左肺、脾頭及肝小葉于生物安全柜內稱重，依次經 2%稀硫酸溶液、生理鹽水漂洗 30 s，1 ml 生理鹽水溫和勻漿后進行 10倍倍比稀釋，分別取 10-3，10-4和 10 -5 稀釋液 50 μl 均勻涂布于中性羅氏培養管內，37℃培養 4 周，計算相應的組織器官荷菌量。另取 10 -1稀釋液 500 μl 接種于 BD BACTEC MGIT 960 培養系統，通過記錄報陽時間進行結核菌的快速檢測。

1.2.5 組織切片

HE染色與鐵染色 小鼠各組織器官，10%中性福爾馬林溶液固定 48 h。組織按長軸最大橫切面修塊、梯度乙醇脫水、石蠟包埋并切成 5 μm 厚度切片，HE 染色后掃描載玻片并保存為 NanoZoomer 數字病理圖像，不同視野下拍照并進行組織病理學分析。鐵染色組織切片脫蠟至水，切片入 Perls 染液浸染 20 min，蒸餾水充分沖洗切片5 min，入核固紅染色液，淡染細胞核 10 min，自來水沖洗 5 s。常規脫水透明，中性樹膠封固，晾干后拍照觀察其病理形態改變及鐵沉積程度。

1.3 統計學分析

SPSS16.0 進行統計學處理，結果以平均數±標準差表示。不同實驗處理組之間差異比較采用單因素方差分析，P ＜ 0.05 為差異有統計學意義。柱形圖采用 GraphPad Prism 5 軟件制作。

一、疾病概述

結核病是由結核分支桿菌（結核菌）引起的一種慢性傳染性疾病，結核感染通常會累及肺、淋巴系統及其它多組織器官。除少數發病急促外，臨床上多呈慢性過程。常有低熱、乏力等全身癥狀和咳嗽、咯血等呼吸系統表現。感染后潛伏期4～8周，其中80%發生在肺部，其他部位（頸淋巴、腦膜、腹膜、腸、皮膚、骨骼）也可繼發感染。

排菌的肺結核患者是傳染源,人與人之間呼吸道傳播是本病傳染的主要方式。大多數的受感染者沒有病癥，稱為潛伏結核感（latentTBinfection），但其中約5-10%的潛伏感染者會發展至活動性結核；若無適當治療，一個活動病例平均每年可使10～15人新受感染，病例本人的死亡率則超過50%。若潛伏感染者同時罹患免疫抑制，如艾滋病，每年就有10%的病發機率。

肺結核病程較復雜，臨床分型有：1、原發型肺結核(Ⅰ型): 肺內滲出病變、淋巴管炎和肺門淋巴結腫大的啞鈴狀改變的原發綜合征。兒童多見，僅表現為肺門和縱隔淋巴結腫大。 2、血型播散型肺結核(Ⅱ型):包括急性血型播散型肺結核及亞急性、慢性血型播散型肺結核。 3、繼發型肺結核(Ⅲ型):可以出現以增殖為主、浸潤為主、干酪病變為主或以空洞為主等多種病理改變。

結核菌進入機體后，被巨噬細胞吞噬，結核菌毒力與宿主免疫力的抗衡決定著結核發病、發展和轉歸。結核病從感染、發病到轉歸均與多數細菌性疾病有顯著不同，宿主反應具有特殊意義，反應分為4期：1.起始期，入侵呼吸道的結核菌被肺泡巨噬細胞吞噬。因菌量、毒力和巨噬細胞非特異性殺菌能力的不同，被吞噬結核菌的命運各異。2.T細胞反應期，由T細胞介導的細胞免疫（CMI）和遲發性過敏反應（DTH）在此期形成，從而對結核病發病、演變及轉歸產生決定性影響。3.共生期，大部分感染者結核菌可以持續存活，細菌與宿主處于共生狀態。纖維包裹的壞死灶干酪樣中央部位被認為是結核桿菌持續存在的主要場所。低氧、低PH和抑制性脂肪酸的存在使細菌不能增殖。宿主的免疫機制亦是抑制細菌增殖的重要因素，倘若免疫損害便可引起受抑制結核菌的重新活動和增殖。4.細胞外增殖和傳播期，固體干酪灶中包含具有生長能力、但不繁殖的結核菌。干酪灶一旦液化便給細菌增殖提供了理想環境。即使免疫功能健全的宿主，從液化干酪灶釋放的大量結核桿菌亦足以突破局部免疫防御機制，引起播散。

結核病的全身癥狀是全身乏力、午后低熱、盜汗、食欲不振、消瘦等；呼吸道癥狀是咳嗽、咳痰、咯血、胸疼、呼吸困難等。其特征性病理改變是肉芽腫病變和結核性結節，其基本病理變化為滲出性病變、增生性病變和壞死性病變。滲出性病變以炎癥細胞、單核細胞肌纖維蛋白為主要成分，增殖性改變以結核結節及結合性肉芽腫為主，壞死的特征性改變為干酪樣改變。結核性炎癥的主要特是上皮樣細胞結節及郎格漢斯細胞。實驗室痰培養為菌陽性，抗酸染色可見細長略彎曲的桿菌，血沉加快。肺的原發病灶、淋巴管炎和肺門淋巴結結核合稱為原發綜合癥，X線影像學上的典型表現為啞鈴狀陰影。感染3-8周后結核菌素皮試轉陽，95%的健康感染者原發綜合征自然消退，成為潛伏感染人群，約5%在日后因潛在感染復燃而發病,結核病起病緩慢，病程較長。

二、模型背景

1、外源鐵及菌株信息

鐵過載模型的外源鐵為右旋糖酐鐵注射液（江西創導動物保健品有限公司）；結核分支桿菌標準株 H37Rv（菌號 97 為 93009，本室保存）

2、實驗動物背景信息

6~8 周齡 SPF 級雌性 C57BL/6N 小鼠

3、研究背景

鐵是人體必需的微量元素之一，廣泛分布在全身各種組織器官，對維持人體的各種生理功能和新陳代謝起重要作用。電子傳遞、細胞呼吸、細胞增殖與分化等過程中均需要鐵的參與[1]。同時，鐵也是病原體毒力和生長的必需微量營養素。臨床 研 究 發現 機 體 “鐵 負 荷 過載 ” (Ironoverload) 與結 核 分 枝桿 菌(Mycobacteriumtuberculosis, Mtb)感染宿主后結核病(Tuberculosis, TB)的發生發展密切相關。一方面，機體鐵過載為胞內 Mtb 生長繁殖和毒力維持提供充足鐵源，促進體內 Mtb 增殖，加速活動性 TB 患者疾病進程。TB-HIV 共感染者中， 高血漿鐵蛋白 TB-HIV 共感染者死亡風險是前者的 3 倍。對比活動性 TB 患者、 非活動性 TB 患者以及健康人群血清 Fe 相關水平發現，TB 的活動性與血清 Fe 水平存在顯著的負相關。另一方面，鐵過載通過誘導羥基自由基產生，激活巨噬細胞氧化應激或凋亡信號通路并下調 TB 患者抗 Mtb 防御型 Th1 反應，削弱機體抗 Mtb 保護性免疫應答從而重新激活休眠的 Mtb，促使潛伏性結核感染的復燃。

盡管鐵過載對機體抗結核免疫應答損傷得到了部分闡明，但鐵過載如何促進巨噬細胞內 Mtb 的生長及其在 TB 的發生發展機制尚需進一步探討。基于此，鐵過載與抗結核感染得到了學者們的日益關注。由于臨床患者個體差異大，取材受限，難以深入研究鐵過載與 TB 之間的關系。本研究擬在利用外源性鐵過載動物模型模擬臨床情況，建立鐵過載結核感染小鼠模型并分析鐵代謝及 Mtb 相關指標，為后續鐵過載與 TB 發病機制研究提供實驗模型。

參考文獻：

1. ME Conrad,JN Umbreit, EG Moore. Iron absorption and transport. Am J Med Sci. 1999;318(4):213-229.

2. Johan RBoelaert, Stefaan J Vandecasteele, Rui Appelberg, et al. The effect of thehost's iron status on tuberculosis. J Infect Dis. 2007;195(12):1745-1753.

3. G MarcelaRodriguez. Control of iron metabolism in Mycobacterium tuberculosis. TrendsMicrobiol. 2006;14(7):320-327.

4. ColinRatledge. Iron, mycobacteria and tuberculosis. Tuberculosis (Edinb).2004;84(1-2):110-130.

5. ITGangaidzo, VM Moyo, EMvundura, GAggrey, et al. Association of pulmonarytuberculosis with increased dietary iron. J Infect Dis. 2001;184(7):936-939.

6. Victor R Gordeuk. African iron overload. SeminHematol. 2002;39(4):263-269.

7. 章淑夢, 周華, 符一騏, 等. γ-干擾素釋放試驗在活動性結核病診斷中的臨床價值 [J]. 中華結核和呼吸雜志.2014;37(5):372-373.

8. SheilaIsanaka, Ferdinand Mugusi, Willy Urassa, et al. Iron deficiency and anemiapredict mortality in patients withtuberculosis. J Nutr. 2012;142(2):350-357.

9. 李劍鵬, 周德玫, 甘楚林, 等. 血清 Fe 和血小板檢測對結核病活動性判斷的臨床價值 [J]. 海南醫學. 2016;27(1):71-73.

10. 曹小立, 趙明峰, 李德冠, 等. 鐵過載巨噬細胞體外模型的建立及氧化應激對鐵過載巨噬細胞的損傷作用 [J]. 中華醫學雜志.2016;96(2):129-133．