新型冠狀病毒再感染恒河猴模型

目前沒有確證 有效的陽性藥物，本單位用細胞模型從市售成藥中篩選有效藥物，發現 PHD1（藥品代號）可以在細胞水平抑制病毒復制，隨后用小鼠模型進行了藥效學評價。發現藥物治療感染小鼠后，臨床癥狀得到改善，病毒復制被顯著抑制，肺組織病理明顯改善，證明該藥物可治療感染小鼠。

1. 本實驗所用的SARS-CoV-2病毒，在研究所已完成風險評估，具有完整的標準操作程序，全部動物實驗活動在ABSL-3實驗室中進行。

2. 本次申報的新資源“新型冠狀病毒再感染恒河猴模型”在實驗過程中嚴格遵守研究所生物安全規章制度和動物實驗規章制度，遵循SARS-CoV-2病毒風險評估和標準操作程序。

3. 感染動物實驗的開展獲得IACUC委員會批準（IACUC號：BLL20001-8）。

1、臨床指征變化情況：

在整個感染過程中，對體重、體溫等臨床特征進行觀察。如圖2A所示，第一次SARS-CoV-2感染后，超過50%的猴子（4/7，M0、M1、M2和M4）的體重減輕了200至400克，然而所有猴子的直腸溫度均未升高（0/7）。在感染后15天左右，感染猴的體重（M2~ M6）逐漸增加到正常范圍（4/5，M4除外，圖2A），直腸溫度維持在正常范圍內（圖2B）。初次感染后，除M4之外，其余6只感染猴觀察到短暫的食欲下降和/或呼吸頻率增加。

在感染后28天，再次感染SARS-CoV-2，猴子表現出短暫的體溫升高，這在初次感染期間是沒有觀察到的。

圖2 新冠病毒再感染恒河猴模型臨床指征的變化情況

2、病毒載量變化情況：

鼻拭子和咽拭子在感染后3天檢測到病毒載量峰值（6.5log10 RNA copies/mL），然后逐漸下降（圖3C和3D）。肛拭子的病毒載量峰值（5log10 RNA copies/mL）低于鼻拭子和咽拭子，也在感染后3天觀察到，然后呈線性下降，在感染后14天降至檢測限之下（圖3E）。在感染后15天左右，所有感染猴的鼻咽拭子和肛拭子的病毒載量均轉為陰性。

再次感染SARS-CoV-2后，在鼻咽和肛拭子中病毒載量在2周內一直保持為陰性。

圖3 新冠病毒再感染恒河猴模型鼻/咽/肛拭子病毒載量的變化情況

3、血液學變化情況：

在所有接受初次攻毒的猴子中，白細胞計數（3.5–9.5× 109/L）、淋巴細胞計數（LYMP, 1.1–3.4 × 109/L）和中性粒細胞計數（NEUT,1.8–6.4 × 109/L）均在正常范圍內波動。與基線相比，初次感染后感染猴的WBC和LYMP有輕微但顯著的降低（圖4F）。

再次感染SARS-CoV-2后，血液學檢測未觀察到顯著波動。

圖4 新冠病毒再感染恒河猴模型血常規變化情況

4、影像學變化情況：

影像學檢查發現雙側膈面模糊，肺部透明度降低，肺左下葉出現小斑影，提示感染猴出現肺炎，表現為中輕度至中度間質炎性浸潤。在28dpi時，胸部x光顯示肺部恢復正常（以M4、M6為代表，圖5G）。

再次感染后，M4、M6感染猴在33dpi（5dpr）影像學檢測未見異常（圖5G）。

圖5 新冠病毒再感染恒河猴模型影像學結果

5、組織分布及病理情況：

對感染猴進行安樂取材，M0（5dpi）和M1（7dpi）中檢測到病毒RNA拷貝，主要集中在鼻（106–108 copies/mL）、咽部（104–106 copies/mL）、肺（103–107 copies/mL）和腸道（104–106 copies/mL）（圖6A）。肺組織進行蘇木精和伊紅（H&E）染色，顯示出輕度至中度間質性肺炎，表現為肺泡間隔增寬，肺泡間質巨噬細胞和淋巴細胞增多，肺泡上皮變性。此外，初次感染后的猴子肺部發現了浸潤的炎癥細胞。通過改良的馬松染色， M0（5dpi）和M1（7dpi）感染猴增厚的肺泡間質中也可以觀察到膠原纖維（圖6B）。免疫組化發現病毒主要分布在肺泡上皮和巨噬細胞中（圖6C），證實了SARS-CoV-2導致恒河猴COVID-19。

M3（5dpr）和M5（5dpr）在二次感染后未在組織中檢測到病毒（圖6A），同時肺部病理檢查未見顯著的病變及免疫細胞的炎性浸潤。

圖6新冠病毒再感染恒河猴模型病毒分布和病理變化的比較

6、免疫細胞變化情況：

從外周血中檢測T和B淋巴細胞的亞群,包括CD4 + T細胞亞群（CD4+ T na?ve、CD4+ Tcm、CD4+ Tem）,CD8 + T細胞亞群（CD8+ T na?ve、CD8+ Tcm、CD8+ Tem），記憶B細胞和漿細胞。這些細胞在初次感染及再次感染后均保持穩定階段。然而，與0dpi相比，在14dpi時觀察到外周血中活化的CD8+ T細胞的百分比增加，同時在再次感染后（0dpr）也發現了這一點（圖7A）。對淋巴結中的免疫細胞進行檢測，再次感染后5天后淋巴結CD4+ Tcm細胞百分比較初次感染后5天高，CD4+ T na?ve細胞和記憶B細胞百分比下降(圖7B)。

圖7新冠病毒再感染恒河猴模型免疫細胞的變化情況

7、抗體檢測：

由于抗SARS-CoV-2特異性抗體水平逐漸升高，21 dpi時的抗體滴度明顯高于3 dpi時，42 dpi（14 dpr）高于28 dpi（0 dpr）的抗體滴度（圖8C）。此外，特異性抗體滴度在14dpr時遠高于14dpi時（圖8C，右側）。重要的是，如圖4D所示，中和抗體的平均滴度在再次感染后呈線性增強。

圖8新冠病毒再感染恒河猴模型抗體的變化情況

1、 實驗材料：SARS-CoV-2病毒；選用體重4-6kg的SPF恒河猴。實驗前體檢無異常，所有感染動物必須在ABSL-3實驗室中進行。

2、 氣管途徑SARS-CoV-2再感染恒河猴模型制作方法：每只動物經氣管途徑給予1毫升體積，106 TCID50 SARS-CoV-2病毒。待確定動物初次感染建立成功后，持續監測病毒載量和疾病表型，在所有動物疾病恢復后，即初次感染后28天，再次經氣管途徑給予1毫升體積，106 TCID50 SARS-CoV-2病毒，創建新冠病毒再感染恒河猴模型。

3、 樣本收集和檢測：按照以下實驗方案對動物進行監測和樣本采集，記錄體重、體溫、臨床體征；采集鼻/咽/肛拭子，測定病毒RNA；采集外周血，檢測血液學和免疫細胞變化；胸片觀察肺部病變情況；采集血清，進行特異性抗體檢測，并在相應時間點進行安樂死和尸檢，檢測病毒組織分布及病理改變。

一、疾病概述

2019冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19），是由嚴重急性呼吸系統綜合征冠狀病毒（SARS-CoV-2）引起，以重癥肺炎、呼吸衰竭為特征的傳染性疾病。SARS-CoV-2病毒傳染性強，自2019年12月在中國武漢出現后，快速在傳播，引發大流行。截至2020年11月17日，SARS-CoV-2累計確診感染人數超5542萬，現有確診人數超過1580萬人，因COVID-19死亡達133萬人。我國累計報告確診病例92482例，死亡4749例。新型冠狀病毒的傳播嚴重影響了人們的正常生活，已成為關注的公共衛生和社會熱點問題，新型冠狀病毒肺炎的防控與治療也是目前研究的熱點。

二、模型背景

1、病原信息

本實驗室分離獲得SARS-CoV-2/WH-09/human/2020/CHN。它具有高度復制能力，并且能經呼吸道傳播，這些特性使它在研究新型冠狀病毒肺炎的傳播、發病機制及疫苗和藥物的快速研發方面具有重要的現實意義。

2、實驗動物背景信息

選用7只體重4-6kg的3-5歲的SPF恒河猴（Maccamulatta）。實驗前體檢無異常，所有感染動物的實驗必須在ABSL-3室中進行。

3、研究背景

新冠肺炎經過治療后，部分患者在出院時未檢出SARS-CoV-2，然而在后續檢測中出現核酸結果呈陽性。最近，有研究表明在COVID-19發病后的10-15天內能檢測到SARS-CoV-2特異性中和抗體(NAbs)，患者在最初感染痊愈后可能有復發或再感染的風險，這引起了全世界的關注。

那么，病人康復后是否會發生病毒復陽？感染新型冠狀病毒后是否會產生特異的抗體？抗體能否保護機體免受再次感染？康復病人血清內的病毒特異性抗體能否用于臨床治療？哪些指標可以證明新疫苗的保護作用？為了回答這些問題，我們建立了新冠病毒短期內再感染的恒河猴模型。我們利用7只恒河猴進行縱向觀察，在初次SARS-CoV-2感染恢復后，再利用同一毒株進行再次攻毒。通過再次感染，觀察再感染動物的病毒和免疫特征，以期對新冠肺炎的“復陽”情況進行研究，為疫苗接種、恢復期血清治療和疾病預后提供重要的參考信息。